自噬干货分享系列之内质网自噬研究

　　上期为大家介绍了自噬干货分享系列之经典自噬研究，那么本期将继续进行＂自噬干货分享＂，小编将带大家一起来了解下内质网自噬。
　　内质网是真核细胞中的一种多功能细胞器，在蛋白质折叠、修饰、脂质和激素合成、离子储存、代谢调节等多种细胞过程中发挥重要作用。当细胞受到内外因素刺激时，未折叠或错误折叠的蛋白质在内质网中大量积累，内质网的稳态就会受到破坏。此时，细胞会启动自我保护程序，即未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR），增强蛋白折叠活性，降低蛋白翻译水平，加速内质网相关蛋白降解（ER-associated protein degradation，ERAD）。持续地内质网应激和未折叠蛋白反应可激活内质网自噬（ER-phagy），以维持内质网的稳态平衡。
　　Bernales等人在2007年首次提出了内质网自噬的概念。内质网自噬可分为（图1）：大内质网自噬（是由内质网驻留受体或内质网相关受体介导，这些受体招募自噬机制，然后将内质网靶向到自噬体中，包裹内质网碎片的自噬体与溶酶体融合以降解其内容物）；微内质网自噬（不需要受体或形成自噬体，内质网碎片直接被溶酶体吞噬）；此外，溶酶体也可直接与内质网来源的囊泡融合并进行降解（需要内质网自噬受体介导，但不涉及自噬体的形成），这一过程也称作ERLAD（ER-to-lysosome-associated degradation）。
　　图1. 内质网自噬
　　本期内容小编将主要从内质网自噬过程、内质网自噬受体、内质网自噬监测方法及应用案例来进行介绍。
　　01内质网自噬过程
　　大内质网自噬是一个多步骤的过程：在内质网应激的诱导下（如未折叠蛋白反应、蛋白质聚集、营养缺乏和内质网结构破坏等），需要降解的内质网成分可以被特定的内质网自噬受体识别和标记。同时，细胞通过抑制mTOR或AMPK直接磷酸化Atg1/ULK1（哺乳动物中Atg1的同源物）来激活自噬体起始复合物，从而启动隔离膜的组装。类泛素蛋白Atg8/LC3/GABARAP将被招募到形成中的隔离膜上来帮助膜扩张，并识别和结合内质网自噬受体。之后，随着隔离膜逐渐扩张和闭合，与待降解的内质网子域以及内质网自噬受体形成自噬体，最终自噬体与溶酶体融合并降解底物（图2）。
　　图2. 大内质网自噬
　　微内质网自噬：在酵母中，当出现内质网应激或内质网过度扩张时，一部分内质网可以形成轮状结构，然后被内陷的液泡膜吸收到液泡中进行降解。在哺乳动物细胞中，突变的I型前胶原蛋白可以被募集到 ERES（ER exit sites，内质网出口位点），COPII 外壳蛋白和自噬相关蛋白（SQSTM1、LC3 等）也可以被募集到这一位点，然后包含这些蛋白的ERES通过泛素化修饰并在微自噬等过程中被溶酶体吞没。
　　ERLAD：当α1-抗胰蛋白酶Z（ATZ）聚合物在内质网中积聚时，分子伴侣蛋白如CALNEXIN可以将聚集体所在的内质网亚区分离。然后，在内质网自噬受体FAM134B的协助下，在该区域形成来源于内质网的、单层膜囊泡。此外，FAM134B与LC3的结合可以促进囊泡对RAB7/LAMP1阳性的内吞溶酶体膜的对接。最终，包含聚集体的囊泡与内吞溶酶体融合而被降解。
　　02内质网自噬受体
　　2015年Nakatogawa和Dikic团队分别在nature杂志报道了酵母和哺乳动物中第一个内质网自噬受体Atg40和FAM134B。到目前为止，哺乳动物中已经有11个内质网自噬受体被报道，FAM134B、FAM134A、FAM134C、RTN3L、CCPG1、SEC62、TEX264、ATL3、CALCOCO1、p62和CDK5RAP3（图3）。
　　图3.内质网自噬受体
　　在酵母中，内质网自噬受体通过Atg8互作基序（Atg8-interacting moti，AIM）与自噬体上的Atg8结合，促进内质网被自噬体包裹。在哺乳动物中发现了6个Atg8同源物，包括LC3 的3种亚型（LC3A, LC3B和LC3C）和γ-氨基丁酸（GABA）-A型受体相关蛋白的3种亚型（GABARAP，GABARAPL1和GABARAPL2）。与酵母中内质网自噬受体和Atg8之间的相互作用一样，哺乳动物中内质网自噬受体也通过LC3互作区（LC3-interacting
　　Region，LIR）与LC3和GABARAP家族蛋白结合，从而促进内质网片段被自噬体包裹。
　　03内质网自噬监测方法
　　内质网自噬活性监测对于阐明内质网自噬的分子机制、生理和病理作用以及寻找调节内质网自噬的药物具有重要意义。
　　透射电子显微镜可以观察内质网自噬（图4），但无法衡量内质网自噬活性。一些内源性内质网蛋白（如RTN1、RTN3、RTN4、REEP5、CLIMP63和Trap-α）在自噬中表达水平下降，但变化通常很小。相比之下，饥饿诱导的内质网自噬受体蛋白（如CCPG1和TEX264）的降解更明显，但它们是选择性降解的，并且在内质网自噬过程中也可能被诱导转录表达，不太能真实反应内质网自噬水平。但荧光标记的报告载体是自噬研究最常用的手段，如汉恒生物自噬研究的 ＂王牌工具＂ mcherry-EGFP-LC3自噬双标病毒等，可以灵敏地衡量自噬水平。
　　图4. 小鼠肾组织内质网自噬透射电镜图（红色箭头表示内质网膜，黑色箭头表示自噬体膜）
　　基于此，汉恒生物最新推出了内质网自噬监测工具。通过将内质网定位序列与RFP-GFP荧光串联序列融合表达来构建内质网自噬报告载体ssmRFP1-EGFP-KDEL（ss：内质网信号肽序列，ER signal sequence；KDEL内质网滞留序列）（图5A）和mCherry-EGFP-RAMP4（RAMP4：即SERP1基因，Stress-associated endoplasmic reticulum protein 1，可以特异性定位到内质网膜上）（图5B）。在细胞质中，红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白同时表达，表现为黄色；若发生内质网自噬，由于溶酶体偏酸性的环境，绿色荧光蛋白淬灭，只剩下红色荧光信号。此外，在溶酶体中，报告载体ssmRFP1-EGFP-KDEL中的mRFP1与EGFP间的linker会被剪切，因此也可通过Western Blot结果统计mRFP1/mRFP1-EGFP比值来指示内质网自噬。
　　图5. 汉恒内质网自噬监测工具原理图
　　04应用案例
　　2019年东京大学研究团队为了研究TEX264是否为内质网自噬受体，利用ssmRFP1-EGFP-KDEL工具对野生型WT、FIP200-KO（自噬功能缺陷）及TEX264-KO的HeLa细胞在营养和饥饿条件下进行了内质网自噬监测，并通过在TEX264-KO的HeLa细胞中回补TEX264野生型及LIR突变型LIR4A，结合荧光成像（图6A，图6B)和Western Blot实验（图6C，图6D)，证明了TEX264是一个内质网自噬受体。
　　图6. ssmRFP1-EGFP-KDEL工具监测HeLa细胞内质网自噬
　　威斯康星大学研究团队2021年的文章中为了研究Atase1或Atase2的敲除是否会促进内质网自噬，利用mCherry-EGFP-RAMP4工具在小鼠胚胎成纤维MEF细胞中监测内质网自噬。通过荧光成像（图7），统计有红色荧光斑点的细胞占比（指示自噬溶酶体），证明了Atase1敲除，而不是Atase2敲除，会促进内质网自噬。
　　图7. mCherry-EGFP-RAMP4工具监测MEF细胞内质网自噬
　　本期＂内质网自噬研究＂的介绍就到此结束了，希望可以帮助大家了解到一定的内质网自噬基础知识，并对内质网自噬监测报告载体有一定的认识。下期我们将继续＂自噬干货分享之线粒体自噬研究＂，我们下期见哦。
　　参考文献
　　He L, Qian X, Cui Y. Advances in ER-Phagy and Its Diseases Relevance. Cells. 2021;10(9):2328. Published 2021 Sep 6. doi:10.3390/cells10092328
　　Bernales S, Schuck S, Walter P. ER-phagy: selective autophagy of the endoplasmic reticulum. Autophagy. 2007;3(3):285-287. doi:10.4161/auto.3930
　　Reggiori F, Molinari M. ER-phagy: mechanisms, regulation, and diseases connected to the lysosomal clearance of the endoplasmic reticulum. Physiol Rev. 2022;102(3):1393-1448. doi:10.1152/physrev.00038.2021
　　Chino H, Mizushima N. ER-Phagy: Quality Control and Turnover of Endoplasmic Reticulum. Trends Cell Biol. 2020;30(5):384-398. doi:10.1016/j.tcb.2020.02.001
　　Mochida, K., Oikawa, Y., Kimura, Y., Kirisako, H., Hirano, H., Ohsumi, Y., et al. (2015). Receptor-mediated Selective Autophagy Degrades the Endoplasmic Reticulum and the Nucleus. Nature 522, 359–362. doi:10.1038/nature14506
　　Khaminets, A., Heinrich, T., Mari, M., Grumati, P., Huebner, A. K., Akutsu, M., et al. (2015). Regulation of Endoplasmic Reticulum Turnover by Selective Autophagy. Nature 522, 354–358. doi:10.1038/nature14498
　　Mochida K, Nakatogawa H. ER-phagy: selective autophagy of the endoplasmic reticulum. EMBO Rep. 2022;23(8):e55192. doi:10.15252/embr.202255192
　　Li J, Gao E, Xu C, Wang H, Wei Y. ER-Phagy and Microbial Infection. Front Cell Dev Biol. 2021;9:771353. Published 2021 Nov 29. doi:10.3389/fcell.2021.771353
　　Chino H, Hatta T, Natsume T, Mizushima N. Intrinsically Disordered Protein TEX264 Mediates ER-phagy. Mol Cell. 2019;74(5):909-921.e6. doi:10.1016/j.molcel.2019.03.033
　　Liang JR, Lingeman E, Ahmed S, Corn JE. Atlastins remodel the endoplasmic reticulum for selective autophagy. J Cell Biol. 2018;217(10):3354-3367. doi:10.1083/jcb.201804185
　　Rigby MJ, Lawton AJ, Kaur G, et al. Endoplasmic reticulum acetyltransferases Atase1 and Atase2 differentially regulate reticulophagy, macroautophagy and cellular acetyl-CoA metabolism. Commun Biol. 2021;4(1):454. Published 2021 Apr 12. doi:10.1038/s42003-021-01992-8