1简介 1992年，日本人Higuchi最早提出了实时荧光定量PCR技术（RealtimePCR）。1996年，美国生物公司推出全球首台荧光定量PCR仪，由PCR扩增热循环系统、荧光检测光学系统、计算机及应用软件组成。通过荧光染料或荧光探针，对核酸扩增产物进行实时监测；通过数学函数关系，结合软件进行结果分析，实现计算待测样品的初始模板量的计算。由此，实时荧光定量PCR技术得到广泛的应用。 RealtimePCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。RealtimePCR通过在PCR扩增体系中掺入荧光染料，检测扩增过程中的产生荧光信号，可以对PCR的扩增进程进行实时检测。且由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。 RealtimePCR主要由定量PCR仪，八联管，试剂及PC分析端等几部分组成。 2原理 RealtimePCR的原理依据测试方法不同存在区别。RealtimePCR主要包括荧光标记法及荧光探针法。荧光标记法指以SYBRGreenI染料法为主的荧光染料嵌合法；荧光探针法指以Taqman探针法为主的淬灭染料引物法。 2。1SYBRGreenI染料法原理 SYBRGreenI是一种高灵敏度的非特异性双链DNA荧光染料，具有绿色激发波长。DNA发生扩增时，SYBRGreenI可以非特异性的结合在dsDNA双螺旋小沟区域。 游离的SYBRGreenI只发出极弱的荧光信号，而嵌合在扩增产物（dsDNA）双螺旋小沟区域中的SYBRGreenI会发出强荧光，荧光信号被千倍放大，且在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。因此，可以通过检测荧光信号的强度从而检测初始dsDNA的浓度。 SYBRGreenI染料法操作简单、灵敏度高、成本较低，被广泛地应用于DNA及RNA定量、基因表达量的研究、转基因重组动植物的研究等，但是因为SYBRGreenI与dsDNA双螺旋的结合是非特异性的。所以SYBRGreenI与特异性扩增产物（目标dsDNA）结合的同时还可以同引物二聚体及非特异性扩增的dsDNA结合，可能影响结果判断。所以扩增反应结束后，还必须对生成的dsDNA进行分析：即通过升温使dsDNA双链解开，SYBRGreenI染料脱落，荧光值逐渐下降，形成温度和荧光强度的曲线：即熔解曲线（Meltingcurve）。依据溶解曲线是否为单峰来判断扩增体系中是否存在引物二聚体或者非特异性扩增（注：因为不同的扩增产物的Tm值存在差异，所以如果产物中存在非特异性扩增，则会出现多峰现象）。 2。1Taqman探针法 Taqman探针是由5’端标记有荧光报告基团和3’端标记有淬灭基团以及与目标基因特异性结合的寡核苷酸序列组成。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，此时仪器不会检测到荧光信号。在PCR扩增时，模板DNA变性解链，Taqman探针特异性结合到目标基因处，而Taq酶具有5’3’核酸外切酶活性，延伸至探针结合处，可将探针水解，使荧光报告基团和淬灭基团分离，从而检测到荧光信号，荧光信号的强度与扩增得到的dsDNA的浓度成正比。荧光信号被仪器检测并采集得到扩增曲线，通过荧光信号的强度反映出体系中dsDNA的浓度。 笔者一般使用的是SYBRGreenI染料法，对Taqman探针不是特别了解。总结Taqman探针法的原理为：Taqman探针法的扩增试剂中包含有5’端标记有荧光报告基团和3’端标记有淬灭基团的寡核苷酸探针（与单链DNA结合）以及能与目标基因特异性结合的含Taq酶（具备5’3’外切酶活性）的寡核苷酸序列。只有发生特异性扩增时，Taq酶才会剪切寡核苷酸探针，将荧光报告基团剪切脱落。从而激发荧光。 参考文章链接： 1。https：zhuanlan。zhihu。comp565126750 2。https：baike。baidu。comitemE5AE9EE697B6E88DA7E58589E5AE9AE9878FPCR5395897 3RealtimePCR机型 为什么要介绍RealtimePCR的机型呢？因为RealtimePCR的上机不同于WB的曝光（WB的曝光可能因为机型的原因，在程序操作上存在区别，但是只要你有条带和显影液，基本上都是能曝光出来的）。 但是RealtimePCR的上机却因为机型的不同存在很大的区别（不要问我为什么知道，当你骑个电动车，拿着配好的模板，逛了三四个实验室发现都无法上机时，你就这辈子都不会忘记RealtimePCR上机存在机型不同了（手动苦涩））。 首先，不同的机型使用的八联管不一样，就笔者所了解的八联管就分为高管、低管及96孔的套管等等。强行使用与机型不匹配的八联管上机不仅无法得到正确的实验结果，而且会损坏仪器（注意：很大概率损坏，因为PCR扩增温度的控制是通过仪器与八联管接触的热盖来进行控制的。如果使用与机型不匹配的八联管进行上机时；eg：高管仪器上低管八联管，仪器热盖与八联管不接触，无法进行PCR扩增；低管仪器上高管八联管，挤压PCR仪热盖，造成仪器损坏）。 其次，RealtimePCR的试剂中有一个叫Rox的试剂，它是仪器的矫正染料，可以矫正孔板及试剂蒸发产生的误差等（这里必须注意的是：不同机型的Rox的种类不同，就我所知的诺唯赞和Takela的试剂中就分RoxI和RoxII）。 仪器介绍链接：https：www。docin。comp2348809832。html 4实验步骤 RealtimePCR的实验步骤并不是非常复杂，主要包括RNA提取反转录体系配制上机及结果分析等几个步骤（以后有机会的话再跟大家介绍）。 5引物设计 最后，给大家介绍一下RealtimePCR的引物介绍： 5。1搜索NCBI 5。2选择Gene，输入需要合成引物的名字及种属 5。3选择对应种属的基因选项 5。4进入后下翻至accessionnumber号 5。5进入后选择PickPrimers 5。6进入后选择扩增产物的大小，及是否跨外显子 5。7点击Getprimers后，可以得到相应的引物 选择引物时：遵循下述原则（见链接） https：www。biomart。cnspecials4abioarticle528822 本文作者：LGN 审核：猪猪 声明：作者水平有限，只代表个人观点。如有建议，可在评论区共同进行相关讨论。 本文主要分享了一些有关RealtimePCR的基础的知识。作者能力有限，一些更深层次的内容欢迎大家在讨论区补充，也欢迎有相关研究方向的学者一起讨论交流，谢谢大家！
取暖方法很多，东北供暖费变明补，爷一样的供热公司，能生存吗？关键还是取暖统一供性价比最高，供热公司享受补贴，个人自己供热无论是电，油，气性价比相差太大。另外污染也是大问题。个人如果允许使用煤做取暖，可能供热公司就挺不住了。只要是允许企业盈利四十左右的男人穿什么颜色的冲锋衣好看？四十了穿什么颜色的冲锋衣都油腻，别费心了。穿点不油腻的吧思考年龄不是关键关键是体型和外形精神气收拾干净了可以穿一些浅色灰色和黑色好，其他花里胡哨的颜色穿起来不沉稳。明黄色，背后写着如果是下岗职工，养老保险还需不需要继续缴纳？养老保险是晚年生活养老金的资金积累，如果你一夜暴富，晚年安度的钱足够，养老保险随时可以放弃。作为下岗职工，我们要明白自己是失业而不是上天，既然连打工拿工资的机会都没有了，难道还有人在国企上12年班了，感觉升职无望，工资又低，现想转入电商行业，这个行业怎么样？我比你大三岁，2018年刚好四十岁，我2003年25岁从国企裸辞出来的，那是一份在工地修高速路的工作，当时月薪2000，因为看不到前路，也不喜欢那份工作，所以铁了心要出来单干，哪怕退休人员退休后返聘，按劳务报酬发放。在年度个税申报的时候，退休工资算在综合个人年度收入里吗？生活中，很多退休人员会继续工作，尤其是那些急缺的技术性工种，企业愿意通过返聘的形式让他们继续在工作岗位上发光发热。对于绝大多数返聘人员而言，他们获得的薪资是劳务报酬，而非工资薪金，国企的领导有行政级别吗？（科级初级等）？在我国，国企是比较特殊的存在。它不是行政事业单位，管理方式都按照企业模式来设定，以效益和利润为先导开展生产经营活动，表面怎么看都是企业。可实际上它又区别于一般企业，在很多方面或多或孩子打针不哭不闹正常吗？孩子打针不哭不闹正常吗？孩子打针不哭不闹是正常的。大部分孩子在面临打针时会出现各种哭闹和不配合，主要原因是因为心理恐惧，觉得打针是件很可怕很疼痛的事情，其次小孩子皮肤比较嫩忍耐力比孩子发烧了，我要出去打麻将，媳妇骂我，我骂回去这样做对吗？绝对不对，你失去了责任和担当，打你都不亏孩子发烧了，你还要出去打麻将，媳妇骂你，你还骂回去，显然是你不对。孩子是你和媳妇爱的结晶，作为一名父亲，你既然决定要了孩子，你就得担起你做父如何区别孩子是精神抑郁还是青春期叛逆？你好，我是心理医生老沈，有失眠抑郁焦虑精神分裂双向障碍等精神心理健康问题，可以关注我私信我，了解更多知识！青春期是多愁善感的自我探索阶段，抑郁症是一种疾病。青春期许多人会变得敏感，四周岁的孩子叫不清楚哥哥怎么办？家长若是发现孩子发音不正，要及时帮助他们纠正错误，那么家长可以从以下几个方面入手，帮助孩子改正他不正确的发音。第一给孩子一个良好的语言环境在跟孩子讲话的时候语速尽量放的慢一些，使用为什么现在很多家长宁愿送孩子去学跆拳道，都不愿学中国武术？跆拳道是进口的，武术是国货，跆拳道馆比比皆是，武术馆难寻，跆拳道教的方法有规矩，武术教练文化素养不高，教的方法比较粗野，我们这有一个文武学校，那里的教头很凶，孩子很害怕，要发扬中国