自进化大孔的超分子水凝胶培养多细胞球

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　　由于能够模拟细胞外基质(ECM)的许多化学和物理信号，水凝胶已成为模拟ECM的可靠选择，并在细胞封装、伤口愈合和组织工程等生物医学应用中具有巨大的潜力。但是传统的低孔隙率水凝胶不能有效地适应和支持被包裹细胞的集落生长和相关功能。因此，迫切需要开发一种新方法来制备具有高度互联大孔结构的可注射水凝胶。
　　基于此，华南理工大学边黎明教授 和赵鹏超副教授 合作提出了一种凝聚液-水凝胶转变策略，通过聚γ-环糊精和蒽二聚体之间的主-客体络合形成的超分子组装物(SA)形成大孔水凝胶(MPH)。弱且可逆的超分子交联使SA具有类液体的流变性能，这有利于SA衍生的大孔凝聚体的形成和随后向MPH的转变(孔径≈100 μm)。与具有相似力学性能的无孔静态水凝胶相比，MPH优异的结构动力学(来源于SA)和空洞形成过程可以更好地适应囊化多细胞球体集落生长所伴随的急剧体积膨胀。 这项工作的发现不仅为具有自进化结构的生物材料的设计提供了有价值的指导，而且为3D多细胞球体培养和其他多样化的生物医学应用提供了有前景的策略。
　　【文章要点】
　　一、γCD-蒽二聚体络合作用介导的SA演化为具有分层多孔结构的MPH
　　为了制备MPH，作者首先合成了三个基本构件：(1)蒽二聚端8臂聚乙二醇(PEG8-二聚体)，(2)醛修饰的γCD (γCD- CHO)和(3)碳酰肼接枝聚乙烯醇(PVA-CDH)。醛基取代度为1.12的γCD-CHO(以下记为γCD-CHO1.12)的加入，将PEG8-二聚体悬浮液转化为透明溶液，从而形成PEG8-二聚体/γCD-CHO1.12配合物。将PEG8 -二聚体/γCD-CHO1.12配合物与PVA-CDH溶液混合后，可通过串联主-客体络合和腙键形成超分子组装体(SA)。特别是在15 w/v %的高浓度下形成的SA(以下简称SA-15)在完全陈化后，由于动态的主客体弱交联作用，仍表现出类似液体的流变行为(存储模量低于损失模量，G’< G＂)。
　　图1 MPH的制备示意图
　　得益于PEG8 -二聚体/γCD-CHO1.12配合物在450 nm左右的强烈蓝色荧光发射，合成的SA-15也显示出明亮的蓝色荧光信号。这种蓝色荧光信号可以潜在地用于跟踪SA-15形成MPH-15的过程，并阐明相关的形成机制。共聚焦激光扫描显微镜图像显示，均质SA-15在PBS处理4 h后首先形成大孔凝聚体。在接下来的孵育时间内，大孔凝聚物的孔径持续增大，然后在培养4天后几乎保持不变(平均在100 μm左右)，成功转化为MPH。由共聚焦荧光图像重建的三维视图清楚地揭示了MPH-15相互连接的多孔结构。在一定的孵育时间内，MPH的孔径大小和孔隙率均与聚合物浓度成反比，表明更密集的聚合物网络可能阻碍SA中的大分子重组。通过改变聚合物浓度、腙键密度、主-客体对密度或/和聚合物亲水性，可以很好地控制MPH内孔隙的形成和形貌。
　　图2 通过γCD-蒽二聚体络合形成SA，并通过凝聚过程进一步转化为MPH
　　二、SA膨胀过程中超分子网络的凝聚诱导了大孔凝聚体的形成，进而形成MPH
　　当浸泡在PBS中时，所有聚合物浓度下SA的重量和溶胀率均显著增加。为了解PBS诱导溶胀在MPH形成中的作用，将共聚焦培养液中制备的SA-15右半部分用盖片覆盖，然后将PBS添加到SA-15的整个顶表面。数码照片显示，有覆盖物覆盖区域的溶胀和云化(微观结构异质性导致的光衍射)过程明显慢于无覆盖物覆盖区域，这是由于有覆盖物存在抑制了PBS对SA-15的可及性。同时，第4天SA-15不同区域的共聚焦荧光图像和对应的强度分布图显示，SA-15衍生的MPH-15的孔径从无覆盖区域逐渐减小到有覆盖区域，符合差异溶化和浑浊的空间趋势。为了进一步了解γCD-蒽二聚体在MPH形成中的作用，合成了醛端8臂聚乙二醇(PEG8-CHO)，然后仅通过腙键与PVA-CDH交联，而没有主-客体交联。PBS处理4天后，NMH-15中没有形成孔隙，证明γCD-蒽二聚体主客体复合物而不是腙键导致了SA-15内聚合物网络的分层组装。
　　图3 37 ℃时SA在PBS中的溶胀促使超分子网络凝聚，最终生成具有凝聚聚合相(孔隙骨架)和稀水相(大孔)的MPH
　　三、由液体样SA进化而来的MPH可作为细胞可注射的多孔支架
　　接下来，作者检测了SA-15和得到的MPH-15的流变性能，以评估MPH-15作为可注射细胞载体的潜力。频率扫描流变学分析揭示了SA-15的频率依赖粘弹性行为，这是由于可逆的主客体相互作用介导的弱而动态的聚合物网络。作为可注射性的关键参数，作者研究了高剪切速率下SA的粘度。随着剪切速率的增加，SA-15的粘度急剧下降，表明SA-15具有剪切变稀的行为。高应变结束后，G’和G＂几乎瞬间完全恢复，表明SA-15具有优异的自愈能力，这可能是由于在去除高应变后，SA网络中分离的主-客体对迅速重新结合。此外，SA-15可以很容易地通过21 G针头注射形成心脏图案，而SA-8甚至可以通过注射器尖端吹成一个大气泡，展示了SA优异的可注射性。为了进一步验证来源于SA-15的MPH-15作为可注射多孔支架的可行性，将小鼠ESCs (mESCs)和人MSCs (hMSCs)分别包裹在SA-15中，并通过21 G注射器针头喷射。注射后，SA-15包裹的两种类型细胞的大多数(> 88%)仍然存活。最重要的是，在培养基中孵育18小时后，SA-15包裹的mESCs聚集在MPC-15的多孔骨架中，而不是从大孔中逸出。以上结果表明，由SA-15演化而来的MPH-15可以作为一种可注射的载体来支持囊化细胞的生长和随后的递送。
　　图4 由类液体SA-15转化形成的MPH可作为细胞的可注射多孔支架
　　四、具有自进化大孔的MPH促进了mESCs和hMSCs的球形集落生长
　　在培养基中孵育后，随着SA-15逐渐转化成MPH-15，mESCs和hMSCs在形成的大孔中聚集生长成大而致密的三维球形集落。相比之下，细胞被封装在与SA-15具有类似的G ＂的NMH-15中，在相同的培养时间后几乎没有增殖，并保持为单细胞，这可能是由于共价交联水凝胶网络的空间限制可能限制了与细胞增殖相关的体积扩张。作者进一步评估了mESCs球状体的多能性和hMSCs球状体在MPH-15内的分化。免疫荧光染色图像显示，在3D mESC培养基中培养7天后，与NMH-15对照细胞相比，MPH-15中的mESCs球体具有更高水平的干性相关标记(Sox2, Oct4和Nanog)表达。与免疫染色结果一致，实时PCR结果也显示，在第7天，与NMH-15组相比，MPH-15组Sox2、Oct4和Nanog的表达水平增加了10 ~ 30倍。这些结果表明，具有大孔的MPH可以促进被包裹细胞的球形集落生长，从而增强细胞功能。
　　图5 MPH可以作为支持多细胞球体培养的多功能平台
　　【小结】
　　作者发现，基于γ-环糊精和蒽二聚体之间主客体相互作用的超分子组装体(SA)可以转化成大孔水凝胶(MPH)。MPH的自进化大孔结构提供了动态和适应性强的细胞周微环境，以支持囊化小鼠胚胎干细胞和人间充质干细胞的集落生长和自我更新，从而促进其多能性维持。这种具有自进化多孔结构的可注射和细胞相容性的MPH将在各种生物医学应用中呈现出巨大的潜力，包括细胞/类器官培养、细胞器模拟、药物/细胞传递和组织再生。
　　原文链接：
　　https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.202300636
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