表观遗传编辑改变基因启动子甲基化提高木薯对白叶枯病抗性

　　易感（S）基因存在于宿主基因组中，不同类别的病原体常常利用它们来侵染宿主。然而，突变这些基因座可能会带来负面影响，因为这些基因通常对正常植物生长和生殖发育至关重要。许多情况下，病原体在感染期间主动上调S基因的表达。Xanthomonas和Ralstonia属的植物病原菌表达转录激活因子样（TAL）效应子，这些效应子可以识别并结合宿主基因组中的启动子序列（效应子结合元件，EBE），从而激活S基因的转录。以前的研究表明，可以使用基因编辑阻止病原体使用S基因，从而增加抵抗力。由于DNA甲基化是一种影响基因表达的表观遗传修饰，因此通过靶向甲基化阻断对S基因的访问可以提高抗病性。
　　近日，来自美国DonaldDanforth植物科学研究中心的RebeccaS。Bart课题组在NatureCommunications上发表了题为Improvingcassavabacterialblightresistancebyeditingtheepigenome的研究论文。黄单胞菌是木薯白叶枯病（CBB）的病原体，它使用类转录激活因子20（TAL20）诱导S基因MeSWEET10a的表达。研究人员将人工合成的锌指DNA结合结构域融合到RdDM途径的某一组件，从而将甲基化定向到MeSWEET10a启动子内的TAL20效应子结合元件。这种甲基化可阻止TAL20结合，阻断体内MeSWEET10a的转录激活，并且这些植物在保持正常生长和发育的同时显示出CBB症状减少。总而言之，这项工作提出了一种对作物改良有用的表观基因组编辑方法。
　　作者首先在木薯中表达了融合锌指DNA结合结构域（ZF）的DMS3（一种RdDM相关蛋白）中，该ZF靶向MeSWEET10a的效应子结合元件。通过使用基于扩增子的亚硫酸氢盐测序（ampBSSeq）评估MeSWEET10a启动子的目标区域的甲基化，作者发现仅表达ZF的植物在MeSWEET10a的EBE处或附近没有显示出甲基化。相反，所有表达DMS3ZF的植物在ZF靶标内和附近都含有高水平的异位CG甲基化，包括EBE内仅有的两个CG位点。用全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）用于评估DMS3ZF的特异性，作者发现在目标区域内观察到高水平的从头DNA甲基化，类似于ampBSseq结果，而两侧5kb扩展区域内的DNA甲基化在表达DMS3ZF的细胞系和单独的ZF对照之间具有可比性。此外，所有染色体以及基因内的CG、CHG和CHH甲基化在DMS3ZF表达系和单独ZF对照之间是相似的。通过预测目标序列中最多4个错配的ZF结合位点（5CGCTTCTCGCCCATCCAT3）来研究潜在的脱靶，共产生了1542个潜在的全基因组脱靶区域。作者比较了WT和两个DMS3ZF表达品系133和204中这些潜在脱靶以及100bp侧翼序列的甲基化水平，没有发现显着差异。作者在发现MeSWEET10a目标区域存在两个高甲基化DMR（差异甲基化区域）。然而，大多数其他检测到的DMR是hypoDMR（即DMS3ZF系中显示甲基化减少的区域）而不是hyperDMR（DMS3ZF系中甲基化增加）。基因组甲基化的整体下降归因于木薯和许多其他植物物种（包括玉米、水稻和油棕）的植物组织培养过程。将观察到的DMR与1542个潜在的脱靶进行比较，发现只有极少数DMR（尤其是hyperDMR）落入脱靶区域，并且这种机会与随机控制区域无法区分。
　　图1。DMS3ZF表达导致体内EBE处的CG甲基化
　　作者接下来测试了TAL20EBE的CG甲基化会阻止体内MeSWEET10a激活的假设。与对照相比，来自独立DMS3ZF表达品系的植物显示出显着缺乏响应Xam感染的MeSWEET10a诱导。MeSWEET10a诱导的抑制发生在独立衍生的转基因品系和独立实验中。这种抑制与DMS3ZF的表达增加无关。这些数据表明甲基化阻止了TAL20介导的MeSWEET10表达激活。
　　为了量化MeSWEET10aEBE甲基化对体内CBB疾病的影响，作者测量了水浸病灶，这是最明显的早期疾病症状，需要诱导MeSWEET10a。对Xam渗入叶片图像的定量分析表明，与野生型相比，EBE甲基化的植物感染面积减少。此外，用野生型Xam浸润的DMS3ZF叶子中的感染区域与用缺乏TAL20的Xam感染的叶子（XamTAL20）相当。在DMS3ZF系中未观察到细菌种群的显着差异。除了病斑大小减小外，EBE甲基化植物中浸润部位及其周围的水浸强度也降低了。将病变图像的灰度值与同一片叶子上的模拟接种部位进行比较，其中更多的水浸泡等同于更暗的外观。在EBE甲基化的植物中，水浸强度降低。这些结果表明，S基因MeSWEET10a启动子内EBE位点的甲基化导致CBB相关症状的减少。
　　总之，这篇文章表明DMS3与人工ZF配对导致在MeSWEET10a的EBE处有针对性地从头建立甲基化，并阻断TAL20诱导的MeSWEET10a异位表达，从而导致CBB疾病症状减轻。
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