表观遗传编辑改变基因启动子甲基化提高木薯对白叶枯病抗性

　　易感 (S) 基因存在于宿主基因组中，不同类别的病原体常常利用它们来侵染宿主。然而，突变这些基因座可能会带来负面影响，因为这些基因通常对正常植物生长和生殖发育至关重要。许多情况下，病原体在感染期间主动上调 S 基因的表达。Xanthomonas 和 Ralstonia 属的植物病原菌表达转录激活因子样 (TAL) 效应子，这些效应子可以识别并结合宿主基因组中的启动子序列 (效应子结合元件，EBE)，从而激活 S 基因的转录。以前的研究表明，可以使用基因编辑阻止病原体使用 S 基因，从而增加抵抗力。由于 DNA 甲基化是一种影响基因表达的表观遗传修饰，因此通过靶向甲基化阻断对 S 基因的访问可以提高抗病性。
　　近日，来自美国Donald Danforth植物科学研究中心的Rebecca S. Bart课题组在Nature Communications上发表了题为Improving cassava bacterial blight resistance by editing the epigenome的研究论文。黄单胞菌是木薯白叶枯病（CBB）的病原体，它使用类转录激活因子 20 (TAL20) 诱导 S 基因 MeSWEET10a 的表达。研究人员将人工合成的锌指 DNA 结合结构域融合到RdDM途径的某一组件，从而将甲基化定向到 MeSWEET10a 启动子内的 TAL20 效应子结合元件。这种甲基化可阻止 TAL20 结合，阻断体内 MeSWEET10a 的转录激活，并且这些植物在保持正常生长和发育的同时显示出 CBB 症状减少。总而言之，这项工作提出了一种对作物改良有用的表观基因组编辑方法。
　　作者首先在木薯中表达了融合锌指 DNA 结合结构域（ZF）的DMS3（一种RdDM 相关蛋白）中，该 ZF 靶向MeSWEET10a 的效应子结合元件。通过使用基于扩增子的亚硫酸氢盐测序 (ampBS-Seq) 评估 MeSWEET10a 启动子的目标区域的甲基化，作者发现仅表达 ZF 的植物在 MeSWEET10a 的 EBE 处或附近没有显示出甲基化。相反，所有表达 DMS3-ZF 的植物在 ZF 靶标内和附近都含有高水平的异位 CG 甲基化，包括 EBE 内仅有的两个 CG 位点。用全基因组亚硫酸氢盐测序 (WGBS) 用于评估 DMS3-ZF 的特异性，作者发现在目标区域内观察到高水平的从头 DNA 甲基化，类似于 ampBS-seq 结果，而两侧 5kb 扩展区域内的 DNA 甲基化在表达 DMS3-ZF 的细胞系和单独的 ZF 对照之间具有可比性 . 此外，所有染色体以及基因内的 CG、CHG 和 CHH 甲基化在 DMS3-ZF 表达系和单独 ZF 对照之间是相似的。通过预测目标序列中最多 4 个错配的 ZF 结合位点 (5＂- CGCTTCTCGCCCATCCAT - 3＂) 来研究潜在的脱靶，共产生了 1542 个潜在的全基因组脱靶区域。作者比较了 WT 和两个 DMS3-ZF 表达品系 133 和 204 中这些潜在脱靶以及 100bp 侧翼序列的甲基化水平，没有发现显着差异。作者在发现MeSWEET10a 目标区域存在两个高甲基化 DMR（差异甲基化区域）。然而，大多数其他检测到的 DMR 是 hypoDMR（即 DMS3-ZF 系中显示甲基化减少的区域）而不是 hyperDMR（DMS3-ZF 系中甲基化增加）。基因组甲基化的整体下降归因于木薯和许多其他植物物种（包括玉米、水稻 和油棕）的植物组织培养过程。将观察到的 DMR 与 1542 个潜在的脱靶进行比较，发现只有极少数 DMR（尤其是 hyperDMR）落入脱靶区域，并且这种机会与随机控制区域无法区分。
　　图1. DMS3-ZF 表达导致体内 EBE 处的 CG 甲基化
　　作者接下来测试了 TAL20 EBE 的 CG 甲基化会阻止体内 MeSWEET10a 激活的假设。与对照相比，来自独立 DMS3-ZF 表达品系的植物显示出显着缺乏响应 Xam 感染的 MeSWEET10a 诱导。MeSWEET10a 诱导的抑制发生在独立衍生的转基因品系和独立实验中。这种抑制与 DMS3-ZF 的表达增加无关。这些数据表明甲基化阻止了 TAL20 介导的 MeSWEET10 表达激活。
　　为了量化 MeSWEET10a EBE 甲基化对体内 CBB 疾病的影响，作者测量了水浸病灶，这是最明显的早期疾病症状，需要诱导 MeSWEET10a。对 Xam 渗入叶片图像的定量分析表明，与野生型相比，EBE 甲基化的植物感染面积减少。此外，用野生型 Xam 浸润的 DMS3-ZF 叶子中的感染区域与用缺乏 TAL20 的 Xam 感染的叶子 (XamΔTAL20) 相当。在 DMS3-ZF 系中未观察到细菌种群的显着差异。除了病斑大小减小外，EBE 甲基化植物中浸润部位及其周围的水浸强度也降低了。将病变图像的灰度值与同一片叶子上的模拟接种部位进行比较，其中更多的水浸泡等同于更暗的外观。在 EBE 甲基化的植物中，水浸强度降低。这些结果表明，S 基因 MeSWEET10a 启动子内 EBE 位点的甲基化导致 CBB 相关症状的减少。
　　总之，这篇文章表明 DMS3 与人工 ZF 配对导致在 MeSWEET10a 的 EBE 处有针对性地从头建立甲基化，并阻断 TAL20 诱导的 MeSWEET10a 异位表达，从而导致 CBB 疾病症状减轻。
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