高效液相色谱法测定植物油中叔丁基对苯二酚的含量研究

　　叔丁基对苯二酚(TBHQ)又名叔丁基氢醌、特丁基对苯二酚，是一种酚类脂溶性抗氧化剂。抗氧化剂是指能防止食品成分因氧化而导致变质的一类添加剂，主要用于防止油脂及富脂食品的氧化酸败，以及由氧化所导致的褪色、褐变以及维生素被破坏等。由于叔丁基对苯二酚具有热稳定性高，遇金属离子不变色，良好的抗细菌、霉菌等优点，所以被广泛的应用于油脂的抗氧化剂，其在控制用量范围内，具有更高的动物和人体安全性。
　　我国《食品添加剂使用卫生标准》(GB 2760-2007)中标定：叔丁基对苯二酚可用于食用油脂、油炸食品、饼干、腌肉制品，其最大使用量为 0.2 g/kg，而美国 FCC(Ⅳ)标准要求其主含量大于等于 99.0 %。本文采用高效液相色谱法测定 TBHQ 含量，方法简便、快速，结果准确可靠，可用于食用植物油等中 TBHQ 的含量测定。
　　1 实验部分
　　1.1 仪器与试剂
　　LC5500 高效液相色谱仪(北京东西分析仪器有限公司)，配备紫外检测器和 LC5500 液相色谱工作站，DL-120J 超声波清洗器，TBHQ 标准品( 99 %，上海紫一试剂厂)，乙腈(色谱纯)，纯净水，添加 TBHQ 的大豆油脂，其它试剂均为分析纯。
　　1.2 对照品溶液配制
　　用差减法精密称取叔丁基对苯二酚(TBHQ)标准品 0.1000 g于 25 mL 容量瓶中，用 V(乙腈) V(水)=1 1 溶解并稀释至刻度，即得对照品溶液。
　　1.3 样品前处理
　　用差减法精确称取 1.0000 g 样品于 15 mL 样品瓶中，加入 5mL 乙腈。在涡旋混合器上混合 2 min 后，在 55  水浴中静置 60s，再涡旋混合 2 min，再在在 55  水浴中静置 60 s 后，取上清液于 2 mL 离心管中，10000 r/min 离心 10 min。取离心后的上层清液用 0.45 m 有机相滤膜过滤于 2 mL 样品瓶中，得供试品溶液。1.4 色谱条件色谱柱：Shim-pack Vp-ODS 反相 C18柱(150 mm4.6 mm，5m)，接 C18 保护柱；流动相：V(乙腈) V(水)=30 70(含 1.5 %乙酸)；流速：0.7 mL/min；检测波长：290 nm；柱温：25  ；进样量：20 L。结果见图 1，叔丁基对苯二酚的保留时间为 4.43 min。
　　2 结果与讨论
　　2.1 色谱条件选择
　　2.1.1 测定波长选择
　　经过波长扫描实验可知，TBHQ 在 227 nm 和 292 nm 各有一个紫外吸收峰，最大吸收波长为 227 nm，灵敏度较高，但 292 nm波长处杂质的干扰较小，具有更高的选择性。因此选择检测波长为 290 nm。
　　2.1.2 流动相条件优化
　　反相高效液相色谱法所用的流动相一般为水、甲醇、乙腈或其中的 2 种或 3 种混合溶剂。对流动相系统分别进行了试验，结果发现乙腈的粘度小，相对于甲醇，柱压较小，有利于保护色谱柱，因此选用乙腈与水的混合溶剂作为流动相。同时还考察了流动相中乙酸含量对分离效果的影响，结果表明，流动相中乙酸浓度为 1.5 %时分离效果较好，峰形也较好，同时对色谱柱的损害较小。
　　2.2 标准曲线绘制
　　精密称取 TBHQ 标准品 0.5000 g 于 50 mL 比色管中，用 V(乙腈) V(水)=1 1 溶解并稀释至刻度，摇匀，制得含量为 10 mg/mL的原始贮备溶液。
　　分别准确量取上述 TBHQ 标准贮备液 0.50 mL、1.00 mL、1.50mL、2.00 mL、2.50 mL、3.00 mL 标准贮备液于 50mL 比色管中，用 V(乙腈) V(水)=1 1 稀释至刻度，摇匀，上述制得的标准溶液的浓度分别为 0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL。分别准确量吸取 20.00 L 上述系列标准溶液进入色谱仪中，测定各 TBHQ 的峰面积，以 TBHQ 峰面积为横坐标，对照品浓度为比纵坐标，绘制标准曲线，将所得数据进行线性回归后，回归曲线方程为 y=33.16589x-0.05048，线性相关系数 R=0.99982。TBHQ 浓度在 0.1~0.6 mg/mL 的范围内具有较好的线性。
　　2.3 精密度试验
　　准确量取 1.2 所配 TBHQ 对照品溶液 3.00 mL 于 25 mL 比色管中，用 V(乙腈) V(水)=1 1 稀释至刻度，摇匀，按照 1.4 所述色谱条件，进样，测定 TBHQ 的峰面积。根据标准曲线计算出TBHQ 的浓度。平行测定 5 次，得到 TBHQ 的浓度分别为 0.51mg/mL、0.48 mg/mL、0.48 mg/mL、0.47 mg/mL、0.46 mg/mL，平均值为 0.48 mg/mL，相对标准偏差为 3.90 %。
　　2.4 重复性试验
　　分别精确称取同一批 TBHQ 标准品 0.01 g，按照 1.2 所述的对照品溶液的配制方法配制 5 份。按照 1.4 所述色谱条件，进样，测定 TBHQ 的峰面积。根据标准曲线计算出 TBHQ 的浓度分别为0.42 mg/mL、0.40 mg/mL、0.39 mg/mL、0.40 mg/mL、0.39 mg/mL，平均值为 0.40 mg/mL，相对标准偏差为 3.06 %。
　　2.5 溶液稳定性试验
　　精确称取 TBHQ 标准品 0.01 g，按照 1.2 所述的对照品溶液的配制方法配制对照品溶液，分别放置 0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h。按照 1.4 所述色谱条件，进样，测定 TBHQ 的峰面积。根据标准曲线计算出 TBHQ 的浓度分别为 0.39 mg/mL、0.39mg/mL、0.40 mg/mL、0.38 mg/mL、0.37 mg/mL，平均值为 0.39mg/mL，相对标准偏差为 2.13 %。
　　2.6 加标回收率测定
　　取已知浓度的 TBHQ 供试品溶液，准确加入一定量的TBHQ标准品，按照 1.2 所述的方法，配制成线性范围内的溶液。在 1.4所述色谱条件下测定，进行加标回收实验，计算回收率。
　　2.7 样品测定
　　取多批食用大豆油，按照1.3 所述方法配制供试品溶液，在1.4的色谱操作条件下，进样，分析。结果表明，大豆油中叔丁基对苯二酚的含量都在规定的范围之内。
　　3 结论
　　从精密度实验、重复性实验、稳定性实验、加标回收率实验的结果来看，该方法的精密度、重复性、回收率良好，符合分析测定的要求。该测方法，简便、快速，结果准确、可靠，可用于植物油脂中叔丁基对苯二酚的含量测定。