不同品种枇杷果实酚类物质及其抗氧化活性解析

　　酚类物质是植物重要的次生代谢产物之一，广泛存在于植物中，影响植物的品质，由于酚类物质结构中携有一个或多个羟基，对自由基有良好的清除能力，表现出很强的抗氧化活性，因而植物酚类物质及抗氧化活性研究成为近年农业科研领域的热点，在枇杷叶、花、核、果已有相关报道。研究表酚类具体的组成及各成分含量与抗氧化能力有很高的相关性，在枇杷花、叶中也得到相同结果，枇杷果实中酚类的组成研究较少，仅张文娜、徐红霞等研究了浙江10个品种的枇杷果实酚类物质组成，其他品种尚未见报道。福建是枇杷的主产区之一，2013年年产量达23。7万吨，主栽的品种有红肉系的早钟6号、长红3号、解放钟和白肉系的白梨等，本实验以这4种枇杷果实为试材，采用超声波辅助乙醇提取法提取其中的酚类物质，用DPPH法（DPPH自由基清除法）和FRAP法（铁还原比色法）来评价其抗氧化能力，并使用高效液相色谱法分析酚类组成，研究不同品种果实酚类组成与抗氧化性关系，并与已研究较多的宁海白比较，以期为枇杷深加工提供科学依据。
　　1材料与方法
　　1。1材料与仪器
　　5种枇杷果实莆田市果树研究所提供，按成熟时间分为早熟的早钟6号，中熟的长红3号和宁海白，中晚熟的白梨及晚熟的解放钟，果实于正常食用成熟度采收，当天运至实验室，选取成熟度一致、无虫害、无明显损伤、果实饱满的枇杷置于70超低温冰箱冷冻保存待用；表儿茶酸、鞣花酸、咖啡酸、阿魏酸、绿原酸美国Sigma公司；新绿原酸、隐绿原酸、TPTZ（2，4，6反式2吡啶基三嗪）、DPPH（1，1二苯基2三硝基苯肼）上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈色谱纯，国药集团化学试剂有限公司；其他试剂分析纯；实验用水超纯水。Agilent1100高效液相色谱仪美国Agilent公司采用紫外检测器ZORBAXSBC18色谱柱（150mm4。6mm，5722型可见分光光度计上海光谱仪器有限公司；KQ100DE型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；KDC40低速离心机安徽中科中佳科学仪器有限公司；Ultrapure超纯水机上海和泰仪器有限公司。
　　1。2实验方法
　　1。2。1枇杷果实酚类物质提取果实从冰箱取出去皮去核后，果肉迅速切成碎末，准确称取10。000g，加入30mL70乙醇溶液，浸泡1h，超声提取20min（温度30，功率200W），再以5000g的转速离心20min，减压抽滤得到滤液，滤液用70乙醇定容至50mL，即为枇杷果实提取液，用于测定DPPH的清除能力和铁离子还原能力及浓缩后用于酚类物质分析。
　　1。2。2总酚含量测定采用FolinCiocaileu比色法测多酚含量，取1mL提取液加入20mL水，2。5mLFoLinCiocaLteu试剂，反应5min后加入2。5mL饱和碳酸钠溶液，最后加水定容至50mL静置2h，于765nm波长处测定其吸光度。以没食子酸（GAE）为标样绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品中总酚含量，结果以样品中含有的没食子酸当量（ggFW）表示。
　　1。2。3提取液枇杷果实抗氧化能力的测试
　　1。2。3。1清除DPPH能力的测定参照文献加以修改，DPPH乙醇溶液浓度为2。13104molL，取等体积的DPPH溶液和枇杷提取液混合，室温避光反应30min后于517nm波长处测定其吸光度（Ai）；等体积的DPPH溶液和乙醇混合，测溶液的吸光值（A0）；等体积的提取液和乙醇混合，测溶液的吸光值（Aj）。记录A0，Ai和Aj，按下列公式计算清除率IP：IP（）〔1（AiAj）A0〕100。
　　1。2。3。2铁离子还原力测定参照文献方法测试提取液FRAP值。取1mL提取液，稀释至25mL。取该稀释液1mL，加入2。7mLFRAP工作液（20mmolL三氯化铁溶液、300mmolL醋酸盐缓冲液、10mmolLTPTZ溶液按1101配制），加入6mL水，37下反应10min后测定593nm处的吸光度。以硫酸亚铁铵溶液为标样绘制标准曲线，以达到相同吸光度所需硫酸亚铁的量来计算样品FRAP值，单位为mmolL。
　　1。2。4枇杷果实提取液的HPLC分析1。2。4。1HPLC检测条件色谱柱：KromasilC18（150mm4。6mm）；进样量：20流速：0。8mLmin；柱温：30；检测波长：280nm；流动相A：5乙酸水溶液；流动相B：100乙腈。梯度洗脱程序：025min时A从90降至70，2535min时A从70升回至90。
　　1。2。4。2酚单体的HPLC分析分别准确称取7种酚单体对照品，用色谱纯的甲醇溶解，配制成0。1mgmL的溶液，测定其保留时间。再配制各酚单体浓度为0。1mgmL的混合对照品溶液并逐级稀释，测定峰面积，计算得到浓度与峰面积的回归方程，溶液测试前过0。45m的滤膜。
　　1。2。4。3样品的处理与分析取25mL的提取液减压蒸馏除去乙醇，再用正己烷萃取3次，通过减压蒸馏除去正己烷后，用甲醇定容到5mL，用于HPLC分析，溶液测试前过0。45m的滤膜，采用外标法计算含量。
　　1。3综合抗氧化能力指数（APC）的计算
　　参照文献计算综合抗氧化能力指数（APC）来进行提取液中酚类物质抗氧化活性的总体比较：APC指数〔每种方法测定值（每种方法测定最大值测试方法总数）〕。
　　1。4数据分析
　　所有测定重复3次，运用Origin8。5软件进行数据作图，运用SPSS20软件进行数据分析：单因素显著性分析（Onewayanalysisofvariance，ANOVA），皮尔森相关性分析（Pearsonscorrelationanalysis）。所得结果采用平均数据标准偏差表示。
　　2结果与分析
　　2。1不同品种枇杷果实总酚含量与抗氧化活性分析
　　没食子酸线性回归方程为y0。0078x0。0026，R20。9986，线性范围：4。1028。67mgL。对照回归方程可得5个品种枇杷果实的总酚含量介于327。31615。22gg之间（见表1），高低顺序为解放钟早钟6号宁海白白梨长红3号，其中宁海白的总酚含量与冯健君的报道吻合，比徐红霞的结果低，可能是由生长环境及成熟度不同引起。早钟6号与解放钟果实的总酚含量接近于长红3号与白梨含量的2倍，组间差异达到显著水平。由表2可知道，5个品种枇杷果实提取液均有抗氧化活性，其中DPPH法显示清除能力排序为宁海白早钟6号长红3号解放钟白梨，早钟6号与解放钟、白梨的差异达到显著水平；FRAP法（回归方程为y0。9686x0。0333，R20。9982，线性范围：0。22。0mmolL测定的结果显示各品种抗氧化能力排序为宁海白早钟6号解放钟长红3号白梨。DPPH法主要评价物质的清除自由基能力，FRAP法评价物质的还原能力，测试方法不同，响应物不同，2种评价结果不完全一致说明反应底物可能有区别，可进一步分析其组成。综合抗氧化能力指数APC显示福建产的红肉系的早钟6号、解放钟、长红3号总抗氧化活性高于白肉系的白梨，早钟6号正是福建主栽的枇杷品种，抗氧化能力较高说明其在营养保健方面有一定优势。
　　2。2不同品种枇杷果实酚类物质组成分析
　　2。2。1不同品种枇杷果实的酚类物质组成定性定量分析参考文献报道，通过对比对照品、样品及加标样品的保留时间，用HPLC法共鉴定出7种酚类物质，按出峰时间排序为：新绿原酸，绿原酸，隐绿原酸，表儿茶素，咖啡酸，鞣花酸，阿魏酸。各酚含量总体上为绿原酸新绿原酸隐绿原酸表儿茶素阿魏酸咖啡酸鞣花酸，绿原酸含量明显高于其他酚类物质，与报道相符，且其在5个品种中的含量差异达到显著水平，其中宁海白中最高，早钟6号次之；新绿原酸和隐绿原酸的含量大小顺序均为宁海白早钟6号长红3号解放钟白梨表儿茶素、咖啡酸、鞣花酸和阿魏酸的含量较低，大小顺序随品种变化较大。整体上看宁海白和早钟6号的各种酚单体含量均比较高，白梨最低；长红3号与解放钟中的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、表儿茶素等的含量差异均达到显著水平，但总含量相近，这与其总抗氧化能力大小相符。
　　2。2。2枇杷果实抗氧化物质组成与抗氧化能力相关性分析从表3可见，总酚含量及HPLC法测定的总含量与DPPH清除能力、FRAP值都呈正相关关系，其中与总酚含量DPPH的相关性到达显著水平，但酚单体与抗氧化能力DPPH、FRAP的关系不尽相同。其中新绿原酸、绿原酸含量与DPPH呈显著的正相关（r分别为0。941、0。887，p均小于0。05），与FRAP存在正相关。隐绿原酸含量与DPPH存在极显著的线性正相关关系（r0。963，p小于0。01），与FRAP存在正相关但相关性不显著。表儿茶素含量与DPPH、FRAP；咖啡酸含量与DPPH、FRAP；鞣花酸含量与DPPH均呈中等强度相关但影响效果不显著。其它酚单体与抗氧化能力的相关性较弱，可能是因为含量较低或者本身抗氧化能力比较弱。
　　3结论
　　运用2种方法来评价枇杷果实抗氧化能力，结果表明宁海白的抗氧化能力最高，白梨的抗氧化能力最低。福建产的枇杷抗氧化能力为：红肉枇杷果实白肉枇杷果实，早钟6号最高。HPLC检测表明在5种枇杷果实中均存在7种酚类物质，分别是新绿原酸，绿原酸，隐绿原酸，表儿茶素，咖啡酸，鞣花酸，阿魏酸。绿原酸含量最高，其次是新绿原酸、隐绿原酸，这三种酚含量与抗氧化能力显著正相关，是主要的抗氧化性活性酚类物质。