谈小剂量辣椒素对大鼠内脏机械及化学刺激敏感性的影响

　　近年来，功能性胃肠病（functionalgastrointestinaldisorders，FGIDs）的发病率正逐年上升，但其发病机制仍不清楚，大量研究显示内脏高敏感在FGIDs发病机制中有着关键作用。随着辣椒素（capsaicin，Cap）缓解疼痛的作用被逐渐认识，Cap对FGIDs内脏高敏感的研究越来越多。一些学者研究发现初次或短期使用Cap，并不能立刻发挥镇痛作用，相反，还会引发或加重疼痛。随着使用时间的延长，Cap才能逐渐展示其镇痛效果〔1〕。Cap通过刺激初级传入神经元末梢和细胞膜上的特殊受体而产生作用，此受体称为辣椒素受体（TRPV1）。Cap可通过激活消化道内TRPV1的表达而影响内脏的高敏感性，但Cap、TRPV1和内脏高敏感的相互作用目前还不完全清楚。因此本研究通过喂食大鼠Cap饲料，研究连续摄入小剂量Cap在不同时间点对不同性别大鼠内脏化学和机械刺激敏感性的影响。
　　材料与方法
　　实验动物清洁级SD大鼠160只，雌雄各80只，体重180200g，饲养2周以适应环境。药品与试剂Cap（99浓度，美国Sigma公司）；10FR导尿管；动物用新斯的明注射液；兔抗大鼠TRPV1多克隆抗体；二步法免疫组化检测试剂（PV6001）；DAB显色试剂盒等。Cap饲料的配制每日新鲜配制，99Cap1mg，加入到普通饲料粉100g，充分混匀成形，即得到Cap浓度为10mgkg1的Cap饲料。实验分组及分期SD大鼠160只，随机分为对照组与观察组，每组80只，雌雄各半。对照组摄入普通饲料；观察组摄入Cap饲料，剂量为Cap1mgkg1d1。每组再随机均分为5小组，分别观察给予Cap后1d、3d、1周、2周和4周的改变，对应观察时间，每小组大鼠16只，雌雄各半。内脏机械刺激敏感性测定采用直肠气囊扩张法。诱导大鼠排尽直肠内粪便，石蜡油涂抹肛周，10FR导尿管气囊端置入大鼠直肠，胶布固定于尾部，采用5mL空针向气囊内匀速注气，边注气边观察腹痛相关行为即大鼠腹部撤离反射行为（abdominalwithdrawalreflex，AWR），当大鼠行为达到AWR评分的4分，结束注气，记录气囊内注入的空气体积即气囊扩张的体积。AWR行为评分标准：（1）在给予刺激时，大鼠情绪基本稳定，评为0分；（2）在给予刺激时大鼠变得不稳定，偶尔扭动头部，评为1分；（3）大鼠腹背部肌肉轻微收缩但腹部并未抬离地面，评为2分；（4）大鼠腹背部肌肉较强收缩并把腹部抬离地面，评为3分；（5）大鼠腹部肌肉强烈收缩，背部成弓形并把腹部、骨盆及会阴部抬离地面，评为4分。内脏化学刺激敏感性测定采用腹腔注射新斯的明方法。大鼠空腹状态，用1mL注射器向腹腔内注射新斯的明注射液，浓度为60gmL1，剂量为120gkg1。注射完毕放入0。5m2干净饲养箱，立即计时，观察大鼠行为变化，记录到大鼠开始出现AWR评分3分时的时间，为化学刺激开始时间；从化学刺激开始时间到大鼠行为首次恢复AWR评分3分时间，为化学刺激持续的时间。免疫组化法观察胃、十二指肠组织TRPV1的表达取大鼠胃、十二指肠组织各一块，固定包埋，采用二步法免疫组化染色检测TRPV1的表达，严格按照试剂盒说明行免疫组化染色。采用彩色病理图像分析软件分析，计算阳性指数（PI），PI阳性信号面积平均吸光度值测定面积，PI值越大，表示TRPV1释放越多。统计学处理结果采用SPSS19。0统计软件分析，计量资料以xs表示，各组数据先进行独立性、正态分布及方差齐性检测，多组样本均数之间比较当方差齐时采用双因素方差分析，方差不齐时采用秩和检验。检验水准0。05，P0。05为有显著意义。
　　结果
　　一般情况所有大鼠精神状态良好，行动灵活，食欲佳，皮毛光滑，大小便正常。Cap对大鼠内脏机械刺激敏感性的影响与对照组相比较，喂食Cap1周，观察组大鼠气囊扩张体积显著减少（P0。002），且雌性较雄性对气囊扩张实验更敏感（P0。001）；相反，喂食Cap4周，观察组大鼠气囊扩张体积显著增加（P0。007）；而喂食1d、3d、2周观察组与对照组之间差异无显著意义（P0。05），见表1。喂食Cap饲料，大鼠对内脏机械刺激敏感性的变化呈先增加后降低的趋势，并以2周时间为分界。
　　Cap对大鼠内脏化学刺激敏感性的影响与对照组相比较，喂食Cap1周，观察组大鼠腹痛相关行为的持续时间显著延长（P0。001），而喂食Cap4周，观察组大鼠腹痛相关行为的开始时间显著延长（P0。02）；其余各组之间差异无显著意义（P0。05），。胃、十二指肠TRPV1表达情况TRPV1免疫阳性产物在大鼠胃、十二指肠组织均有表达，呈棕黄色或黄色颗粒。与对照组比较，给予Cap1d、3d、1周后，观察组TRPV1表达显著高于对照组（均P2、4周后，观察组与对照组之间差异无显著意义（P十二指肠组织TRPV1的PI值：与对照组比较，给予Cap1d、3d后，观察组显著高于对照组（均P1、2、4周后，观察组与对照组之间差异无显著意义（P0。05）。
　　讨论
　　Cap是从辣椒中提取的主要辛辣成分之一，化学名为反8甲基N香草基6壬烯基酰胺。研究发现辣椒中富含的Cap除了能促进胃内黏液分泌，增加黏膜血供来保护胃黏膜，还可能促进胃肠蠕动，调节内脏高敏感，甚至抑制消化道肿瘤发生。Cap有刺激兴奋、感觉阻滞、长时程选择性神经毒性损害和不可逆性细胞破坏四种药理效应，它的最终效应取决于给药的剂量和时间。初次或小剂量（10mgkg1）的Cap作用于CAP敏感传入神经（CSANs），可使该神经纤维产生一时性的兴奋，释放某些神经递质，向上级神经元传递信号，称为刺激兴奋；当继续或反复使用Cap，可使兴奋的CSANs耗竭大量的神经递质而对刺激无反应，出现脱敏现象，又称为Cap的感觉阻滞作用；大剂量的Cap在引起原初级刺激兴奋作用后，可引起神经递质的过量释放，导致CSANs受到严重损害，失去其信息传入功能，此为Cap选择性神经毒性损害，甚至不可逆性细胞破坏，亦称为Cap的化学去神经作用。关于辣椒素的剂量，研究认为小剂量（10mgkg1）的Cap可引起刺激兴奋；大剂量（50mgkg1）的Cap可使CSANs产生化学去神经作用；中等剂量（1050mgkg1）Cap可能会使兴奋的CSANs产生感觉阻滞作用。本研究选用1mgkg1d1Cap，即小剂量Cap进行实验。
　　Cap既可致痛又可止痛，初次应用Cap，可产生烧灼样的疼痛感。CAO等观察42例健康志愿者服用Cap胶囊后，23d时间内有38例出现了上腹疼痛，其中部分志愿者15min即出现症状；但随着给药时间延长，逐渐出现止痛的效果，BORTOLOTTI等肠道功能性消化不良（FD）患者连续3周摄入0。35mg剂量的Cap胶囊腹痛症状有所改善，FUHRER等研究发现肠易激综合征（IBS）患者连续服用Cap胶囊4周后，其对不良化学刺激耐受性显著提高。大量研究证实FD及IBS患者具有内脏高敏感性，表现为胃和直肠对机械或化学刺激疼痛阈值降低，TACK等的研究显示约有34的FD患者存在内脏高敏感。如果应用Cap缓解内脏高敏感，需渡过其短期致痛效应，延长Cap的应用时间至关重要。也就是说，若要开发Cap作为镇痛药物治疗慢性腹痛症状，疗程可能较普通药物更长。本实验将内脏刺激分为机械刺激和化学刺激，结果显示，摄入Cap1周大鼠机械和化学刺激敏感性显著增加，2周敏感性均下降，和正常水平相当，而到4周时敏感性显著降低。另外，在本实验中出现了机械刺激敏感性的性别差异，摄食Cap饲料1周，雌性大鼠敏感性显著高于雄性大鼠，推测可能与雌激素抑制结肠平滑肌的收缩活动，延缓胃肠转运有关。
　　TRPV1被称为瞬时感受器电位通道，广泛分布于脊髓背根神经节、三叉神经节、自主神经节的中、小神经元上，以及胃肠道、食管黏膜、黏膜下层、平滑肌层以及血管周围。大量研究显示，在FD及IBS患者中，腹痛症状与TRPV1的表达可能有一定的相关性。TRPV1敲除降低了胃食管、空肠和结肠传入神经在扩张刺激下的机械敏感性。陈晓敏等对IBS患者腹痛症状进行评估，同时检测直肠、乙状结肠交界处组织TRPV1的表达情况，结果发现IBS患者结肠组织TRPV1表达显著高于对照组，且与腹痛程度呈正相关。目前认为，Cap通过激活TRPV1在内脏高敏感中发挥重要作用。短期或初次应用Cap，可通过激活TRPV1，促进神经元内神经递质释放，引起局部疼痛、烧灼样感觉，连续刺激递质将被耗竭，神经元不再敏感，疼痛刺激将不再起效。本实验显示，喂食辣椒饲料1d、3d、1周大鼠胃组织TRPV1表达显著升高，2周和4周时下降至正常水平。大鼠内脏机械和化学刺激敏感性的改变，可能与TRPV1的表达水平相关。短期内摄入Cap使TRPV1的表达上调，增加了内脏对机械及化学刺激的敏感性；持续应用Cap，机体逐渐适应，TRPV1的表达也随之下降，因而敏感性也随之降低。综上所述，连续摄入小剂量Cap1周，大鼠对内脏机械或化学刺激的敏感性显著增加，其中雌性对内脏机械刺激较雄性更为敏感，连续2周敏感性逐渐恢复至正常，连续4周敏感性显著降低，且大鼠胃、十二指肠黏膜屏障均无明显影响。四川是辣椒的产地之一，辣椒素原料丰富原料价格便宜，Cap能否作为治疗内脏高敏感患者的新药及其口服剂量和治疗疗程，有待进一步研究。