有机肥对土壤中抗生素降解的促进作用的研究

　　随着抗生素应用范围和使用频率的不断增加，抗生素对环境的污染问题逐渐受到人们的重视。众多研究表明，农田土壤是人类处方药抗生素和兽用抗生素的主要归宿地，抗生素主要通过排泄物、生活垃圾、污水、城市污泥和伺养场垃圾等作为肥料伴随施用进人土壤。据报道，土壤中检测出抗生素的残留量可在g/kg 级至g/kg级之间变化。一些调查与试验表明，农田土壤中的抗生素可被作物吸收，并可能对作物生长产生影响。另外，进人土壤等环境中的抗生素还可致环境微生物产生抗药性，对人类的公共健康构成潜在威胁。因此，防止农田土壤中抗生素的污染、加速进人土壤中抗生素的降解是避免抗生素对农作物和人类产生危害的重要途径。抗生素属于有机物，可通过各种方式降解，但其降解速率与抗生素种类、环境条件等有关。一些试验表明，残留在畜禽粪便中的抗生素可在堆肥过程中发生显著的降解。微生物是环境中抗生素降解的主要推手，施肥是农田培肥的重要措施，施用有机肥常可增强土壤微生物活性，从而有可能影响土壤中抗生素的降解。为此，设置了施用不同量有机肥的盆栽试验，以探讨有机肥施用对土壤中抗生素降解的可能作用。
　　1材料与方法
　　1. 1试验材料
　　供试土壤采自浙江省绍兴市柯桥区，为青紫泥田(属水稻土土类)，采样深度为0~15cm。该土样有机碳含量为19.2 g/kg，pH为6. 13，质地为粘壤土，土壤有效P含量为8.76 mg/kg，有效K为98 mg/kg。检测表明，试验前土壤无恩诺沙星、磺酸二甲嘧啶和泰乐菌素等抗生素检出，但含少量土霉素残留(含量为38. 6 g/kg)。土样在试验前风干、混匀，过5 mm土筛。
　　1.2试验方法
　　试验共设4个处理，分别为(I ) CIA(对照):不添加抗生素，未施用有机肥;(II) ANT抗生素处理):添加土霉素、恩诺沙星、磺酸二甲嘧啶和泰乐菌素等4种抗生素各25mg/kg，未施用有机肥;(III ) ANT + 0. 5 OM(抗生素+0. 5%有机肥处理):添加土霉素、恩诺沙星、磺酸二甲嘧啶和泰乐菌素等4种抗生素各25 mg/kg，同时施用0. 5%有机肥;(1V)ANT+1.0 OM(抗生素+1. 0%有机肥处理):添加土霉素、恩诺沙星、磺酸二甲嚓陡和泰乐菌素等4种抗生素各25 mg/kg，同时施用1. 0%有机肥。施用的有机肥为商品有机肥，有机质含量为45.2% , pH为7.43,全N含量为14. 43 g/kg，P2O5量为9. 76 g/kg，K2O含量为22. 65 g/kg。
　　试验每盆用土量为5 kg，每个处理重复3次。在以上处理的基础上，每盆各施复合肥(N-P2O5-K20含量为15-15-15 )1 g。抗生素、有机肥和化肥同时均匀混人土壤，培养7d后，每盆移栽4株15 d龄的青菜幼苗(品种为苏州青)。分别在添加抗生素后的1,2,4,8,16,32和52 d，从各盆中采集混合土样，测定土壤中抗生素的残留量和微生物生物量碳。蔬菜生长45 d后收获地上部分，测生物量，并分析抗生素含量。采集的土样冻干后研磨过2 mm土筛，在分析前冰冻保存。采集的蔬菜样品先后经自来水、蒸馏水洗净后用吸水纸吸干，4 保存。
　　1.3分析方法
　　蔬菜样品中抗生素采用超声提取一固相萃取预处理和高效液相色谱一串联质谱(HPLC-MS/MS )分析法测定，采用乙睛-硫酸钠-乙酸钠-Na2 EDTA溶液/超声波提取，用正己烷液-液萃取，用旋转蒸发法浓缩，用乙睛-0. 086 mol / L 磷酸(15: 85, V/V)定容至5 mL,隔夜沉渣，吸取1 mL溶液过0. 2 m滤膜后用HPLC-MS/MS法测定。土霉素、恩诺沙星、磺胺二甲嘧啶和泰乐菌素的回收率分别为83. 43%~112.3% ,79. 67%~106. 54% , 85. 67%103. 43%和86. 34%~99. 34%，平均分别为96.4% ,93.6% ,95. 8%和96.7%，最低检测限分别为0.13,0.095,0.12和0. 15g/kg。土壤中抗生素用pH为4的EDTA-McIlvaine ( 0. 05 mol/L EDTA+0. 06 mol/L，Na2HPO4 + 0. 08 mol/ L柠檬酸)缓冲液提取，用高效液相色谱一串联质谱(HPLC-MS/MS )分析法测定。
　　2结果与分析
　　2. 1有机肥对土壤中抗生素降解的影响
　　研究表明，土壤中4种供试抗生素的含量均随培养时间的延长而显著下降(图1)0 4种供试抗生素在土壤中的降解速率以磺酸二甲嘧啶最高，其次为恩诺沙星，泰乐菌素最低。对于未施用有机肥只添加抗生素的处理(ANT )，在培养结束时(培养时间为52 d)，土霉素、恩诺沙星、磺酸二甲嘧啶和泰乐菌素在土壤中的平均残留含量分别为8.30,5.35,1.40和13. 83 mg/kg，相应的抗生素降解率分别为66.8% ,78.6% ,94. 4%和44.7%。
　　用有机肥可促进土壤中各类抗生素的降解，4种供试抗生素的降解率均随有机肥用量的增加而增加。在培养结束时，不施用有机肥的处理(ANT)、施用0. 5%有机肥的处理( ANT + 0. 50M)和施用1. 0%有机肥的处理(ANT + 1. 0 0M)的土霉素降解率分别为66.8 % ,73. 6%和76.8%，恩诺沙星降解率分别为78.6% ,82. 4%和84.2 %，磺酸二甲嚓陡降解率分别为94.4 % , 97. 1%和98.2%，泰乐菌素降解率分别为44.7% ,49. 2%和52.4%。施用有机肥对土壤中抗生素降解的促进作用在试验前期最为明显，试验后期施用有机肥与未施用有机肥处理的土壤抗生素降率差异有所减小。在培养时间为8d时，施用1%有机肥处理比未施有机肥处理的土霉素、恩诺沙星、磺酸二甲嘧啶和泰乐菌素降解率分别高出12. 9 ,13. 5 ,24. 8和12. 0个百分点，至培养结束时相应的降解率差值分别为10. 0,5. 6,3. 8和7. 7个百分点。
　　抗生素在土壤中的降解与其化学结构、所处土壤pH、土壤溶液中离子浓度、温度、水分、通气性、N03，NO2，Fe，Fe2+Fe，NaCI, TiO2等光敏剂及土壤微生物组成及活性等有关[}a}。降解机理主要有水解、光解和生物降解作用。本试验中采用相同的供试土壤，不同处理间的差异主要是有机肥施用与否及其施用量，据此推断，施用有机肥之所以能促进土壤中抗生素的降解，可能与有机肥施用增加了土壤中微生物活性、增强了抗生素的生物降解有关。施用有机肥处理可显著增加土壤中微生物生物量碳，而增加程度在前期(第8天)更为明显(施用0. 5%有机肥处理和施用1%有机肥处理的土壤微生物生物量碳分别为未施有机肥处理的187 %和213% );至培养后期，施用有机肥处理的土壤微生物生物量碳有所下降，但仍高于未施有机肥处理(施用0. 5%有机肥处理和施用1%有机肥处理的土壤微生物生物量碳分别为未施有机肥处理的129%和143%)。
　　抗生素的微生物降解主要是通过微生物直接破坏和修饰抗生素而使其失活，包括水解、基团转移和氧化还原3种机制，使抗生素残留物的结构发生改变，从而引起其化学和物理性质的改变，最后分解成为H2O和CO2。土壤环境中的耐药菌，如光合菌、乳酸菌、放线菌、酵母菌、发酵丝状菌、芽抱杆菌、枯草杆菌、硝化细菌、酵母等都具有降解抗生素的功能。
　　2. 2有机肥对蔬菜生长的影响
　　图3为4个不同处理的土壤上生长45 d的蔬菜地上部分鲜重。与对照(CK)相比，只添加抗生素处理的土壤(ANT)上生长的蔬菜鲜重显著下降，下降幅度为12.4%，而对于同时施用抗生素与0. 5%或1. 0%有机肥的土壤上生长的蔬菜，其地上部分鲜重与对照无明显差异，平均产量比对照略有增加，分别增加1. 04%和5.2%}对试验过程中蔬菜生长状况的观察表明，只添加抗生素处理的土壤上生长的蔬菜与对照在生长前期(5~15d)差异最为明显，之后差异有所减少。而2个有机肥处理的土壤上生长的蔬菜与对照之间的差异一直不明显。这一结果表明，土壤抗生素污染较为严重时(各类抗生素污染的初始浓度为25 mg/kg)，抗生素对蔬菜幼苗生长有一定的抑制作用。前人的研究也表明，当土壤抗生素达到较高水平时，抗生素可限制根系生长和地上部分的株高。加人有机肥处理后，抗生素对蔬菜生长的抑制变得不明显，这可能有以下2方面的原因:一是有机肥加快了土壤抗生素的降解，减弱了抗生素对蔬菜生长的影响;二是有机肥的施用增加了土壤有效养分，从而在一定程度上促进了蔬菜的生长。
　　2. 3有机肥对蔬菜中抗生素含量的影响
　　在未施用抗生素的土壤(CK)上生长的蔬菜仅检测出少量的土霉素，未检出恩诺沙星、磺酸二甲嘧啶和泰乐菌素等抗生素，蔬菜中微量土霉素的存在可能与供试土壤中有少量土霉素残留有关。而经抗生素处理的土壤上生长的蔬菜中均有明显的4类抗生素检出，这表明土壤中抗生素可被供试蔬菜吸收，积累在蔬菜组织中。但3个含有抗生素处理(ANT , ANT + 0. 5 OM , ANT+1. 0 OM)的土壤上生长的蔬菜中抗生素含量有较大的差异。总体上，蔬菜中4类抗生素含量以泰乐菌素最高，其次为土霉素，而恩诺沙星和磺酸二甲嘧啶含量相对较低。施用有机肥( ANT + 0. 5 OM , ANT+1. 0 OM)的蔬菜中抗生素含量明显低于未施有机肥的处理(ANT)。施用1%有机肥处理的土壤上生长的蔬菜中抗生素含量略低于施用0. 5%有机肥处理的土壤上生长的蔬菜。施用0. 5%有机肥处理的土壤(ANT + 0. 5 OM)上生长的蔬菜中土霉素、恩诺沙星、磺酸二甲嘧啶和泰乐菌素含量分别比未施有机肥的土壤(ANT)低61.7% ,62.8% ,37. 4%和46.8 %，施用1. 0%有机肥处理的土壤(ANT + 1. OOM)上生长的蔬菜中土霉素、恩诺沙星、磺酸二甲嘧啶和泰乐菌素含量比未施有机肥的土壤低67.8 % ,66.3% ,49. 4%和48.9 %蔬菜中各类抗生素含量的变化及不同处理间同类抗生素含量的变化与土壤中残留的抗生素水平基本一致。施用有机肥降低了蔬菜中抗生素的含量，这可能有2个方面的原因:一是有机肥促进了蔬菜的生长，增加了蔬菜的生物量，从而使蔬菜地上部分抗生素的浓度降低(稀释效应);二是有机肥促进了土壤中抗生素的降解，减少了蔬菜对土壤中抗生素的吸收。但与降低蔬菜中抗生素含量相比，有机肥对蔬菜生物量的影响较小。因此，施用有机肥之所以能够降低蔬菜中抗生素的含量，主要与有机肥促进了土壤中抗生素的降解有关。上述结果表明，有机肥的施用不仅影响了土壤中抗生素的降解，同时也明显了降低了蔬菜对土壤中抗生素的吸收。
　　3小结
　　本研究表明，施用有机肥可增加土壤微生物
　　生物量，促进土壤抗生素的降解，这一效应随有机肥用量的提高而增加，而且有机肥对土壤中抗生素降解的促进作用在土壤培养前期更为明显。施用有机肥显著减少了蔬菜地上部分抗生素的含量，且有机肥用量为1. 0%时比0. 5%效果更显著。与无抗生素污染对照土壤比较，添加抗生素使蔬菜生物量明显下降，施用有机肥有利于缓解抗生素对蔬菜生长产生的不良效应。