论述发酵生产谷胱甘肽的研究进展

　　谷胱甘肽（GSH）是一种由L谷氨酸、L半胱氨酸和甘氨酸组成的3肽。在临床上用于保护肝脏、治疗肿瘤、解除氧中毒、抗衰老和治疗内分泌紊乱等疾病，在医疗、食品、保健品生产及体育运动和有关生物研究领域有广泛市场。
　　1菌种选育
　　能够生产谷胱甘肽的菌株主要是酵母菌、酿酒酵母和热带假丝酵母，其菌体内GSH含量较高，且能长时间保持合成GSH的能力。发酵法生产GSH的重点在于优良菌种的选育，以常规诱变育种以及遗传工程技术就可以得到优良的生产菌株。
　　1。1常规诱变育种
　　传统诱变育种大致可分为2类：一是物理诱变方法，如紫外线诱变、放射线诱变、超声波诱变等；二是化学诱变方法，主要是用化学诱变剂处理，如亚硝酸盐、亚硝基胍、叠氮化钠、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯等。抗性筛选中常用的抗性筛选物有甲硫氨酸、乙硫氨酸、氯化锌、三氮唑等。
　　克热木江阿布都热合曼用酿酒酵母作为出发菌株，先用紫外诱变筛选抗氯化锌突变株，再用亚硝基胍诱变筛选三氮唑和叠氮化钠抗性突变株，最后又用紫外和亚硝基胍复合诱变，最终得到的GSH高产突变株产量为162。0mgL，比出发菌株产量提高了404。7。王小娟用一株稳定高产的假丝酵母作为出发菌株，经过紫外诱变，氯化锌、甲硫氨酸抗性物交替筛选得到的突变株，谷胱甘肽产量是出发菌株的150。李小娟从自然环境土壤样本中分离筛选出一株谷胱甘肽（GSH）产量为35。4mgL的酵母菌株Y51；经紫外线诱变、亚硝基胍诱变后，分别用乙硫氨酸、氯化锌和三氮锉3种抗性平板进行抗性筛选，得到一株GSH高产菌株Y512115；对该菌株摇瓶发酵生产GSH的工艺条件进行优化后，菌株Y512115产GSH量达158。4mgL，较出发菌株提高3。5倍。郝淼闻研究半胱氨酸对S。cerevisiaeY08的GSH生产性状影响基础上，对菌株进行紫外亚硝酸复合诱变，在含有不同质量浓度半胱氨酸的高渗培养基上筛选半胱氨酸抗性菌株，所筛选到的菌株能够在发酵初期较高质量浓度的半胱氨酸环境下正常生长，并可以利用半胱氨酸高产GSH。
　　1。2基因工程育种技术
　　基因工程育种技术可实现超远缘杂交，是一种可预先设计和控制的育种新技术，其筛选标记广泛、机理较明确、高产菌株的筛选率比较高，近20年来发展较快；国内也有许多学者正在致力于研究利用这种技术来提高GSH产量。目前，能够操作的菌株有大肠杆菌、毕赤酵母、乳酸乳球菌等，通常采取对GSH合成酶系的改造，进而提高GSH的含量。郝瑞颖构建酿酒酵母工程菌提高其产谷胱甘肽的能力，通过酶切带有GSH和铜抗性筛选标记CUP1基因的载体pICG获得GI表达载体盒，并将其同源重组整合至工程菌株RA的乙酰乳酸合成酶基因ILV2染色体基因组上。结果显示，工程菌RIA的GSH产量较出发菌株显著提高了18。7（p0。05）。陈加利等人用PCR扩增酿酒酵母的GSH及GSH基因，以乙醇脱氢酶（ADH1）启动子进行表达，并以Kanr基因和Hygr基因作为筛选标记，构建了2个重组表达质粒。采用电击法将这2个质粒分别和同时转入工业酿酒酵母菌株，在含有G418或（和）Hyg的平板上筛选阳性克隆S。TS013GSH，S。TS013GSH和S。TS013GSHGSH。将重组菌进行摇瓶发酵，结果显示不同转化子重组菌的谷胱甘肽产量相比宿主菌分别提高了44。11，29。79和56。47。王玮玮〔7〕综述了谷胱甘肽生物合成及代谢相关酶的研究进展和利用基因工程手段构建谷胱甘肽高产菌株，也不仅局限于谷胱甘肽自身的生物合成和代谢，半胱氨酸的合成、蛋氨酸的合成和谷胱甘肽合成过程中基因表达的调控及谷胱甘肽的胞外转运，对于胞内谷胱甘肽水平也有重要影响。方聪明〔8〕利用基因工程的方法，以高产GSH酿酒酵母S。cerevisiaeCCCG为研究对象，构建了酿酒酵母GSH合成中关键酶基因：谷氨酰半胱氨酸合成酶基因（GSH1）和谷胱甘肽合成酶基因（GSH2）的大肠杆菌工程菌，再经表达、分离纯化得到GSH1，GSH2重组蛋白，并研究它们的酶学性质，最后基于GSH1，GSH2的酶学性质对酿酒酵母发酵产GSH进行研究。
　　2培养基与培养条件优化
　　选育一株高产的菌株之后，对其菌种的培养基以及培养条件进行优化则可以进一步使产量增加，并且一些试验设计和数理统计方法的引入，能有效地设计试验方案。谢丽等人选育菌种，并研究酵母粉与硫酸铵对胞内谷胱甘肽含量影响最大。以硫酸铵为氮源时，GSH含量可达到25。48mgg；补加葡萄糖的时间为接种后10h，补加量为16mL时，最佳条件下得到菌体干质量为8。14gL，通过摇瓶发酵GSH产量为113。45mgL，GSH产量提高了2。89倍。黎明从果园土壤中筛选到一株产谷胱甘肽的酵母菌YS10，经26SrDNA鉴定为酿酒酵母Saccharomycescerevisiae，正交试验获得该菌株产谷胱甘肽合适的发酵培养基为葡萄糖3。0，酵母膏0。7，硫酸铵1。0，磷酸二氢钾0。3，硫酸镁0。05，通过发酵条件的优化，该菌在500mL三角瓶装量50mL，30摇瓶培养72h，谷胱甘肽的产量可达183。04mgL。杨莉〔11〕通过单因素及正交试验对酿酒酵母摇瓶发酵产谷胱甘肽的培养条件优化进行了研究。结果表明，影响酿酒酵母摇瓶发酵产谷胱甘肽的主要因素有葡萄糖浓度、接种量、装液量和发酵时间。试验确定的最佳条件为葡萄糖添加量20gL，温度30，装液量50mL，接种量8，发酵时间54h。条件优化后谷胱甘肽的含量比原来增加了4。21，谷胱甘肽的产量比原来增加了15。81。朱虹〔12〕在摇瓶条件下，利用Minitab16软件中的响应面法对酿酒酵母发酵生产谷胱甘肽的培养基进行了优化，首先通过PlackettBurman设计方法对影响发酵各因素的效应进行评价。结果表明，葡萄糖、酵母粉、半胱氨酸3个因素对谷胱甘肽产量影响显著，其中葡萄糖、酵母粉呈正效应，半胱氨酸呈负效应，其他因素的影响不显著。利用最陡爬坡试验，接近重要因素的最优水平，然后应用中心组合设计结合响应面分析确定了重要因素的最优水平。优化后的发酵培养基组成为葡萄糖34。9gL，酵母粉12。7gL，半胱氨酸0。053gL，硫酸铵7。5gL，磷酸二氢钾9gL，硫酸镁1。5gL，生物素0。1mgL，在此条件下进行摇瓶发酵，谷胱甘肽理论产量达到170。58mgL。经3批平行试验验证，谷胱甘肽的平均产量为168。72mgL，与预测产量接近，比优化前产量（113。43mgL）提高了约48。7。证明用响应面设计方法寻求菌体积累谷胱甘肽的最佳培养基组分是可行的。
　　除此之外，还采取了其他措施来提高GSH的含量。郑丽雪通过摇瓶发酵培养，研究了Cu2，Mg2，K，Fe2，Mn25种金属离子在不同发酵时间添加对酿酒酵母CS105151生产谷胱甘肽的影响。试验结果表明，在发酵初期（0h），当K，Mg2，Fe2添加量分别为0。15，0。12，0。09gL时，GSH的产量分别为88。53，52。73，41。42mgL，相比空白对照分别提高了63。50，36。58和44。25。在15h时，当Mg2添加量为0。09gL时，GSH产量为61。75mgL，比对照组提高82。01；当发酵至24h时，金属离子的添加对GSH的产量无明显促进作用。万红贵〔14〕研究了氧化刺激和高渗刺激对啤酒废酵母发酵产谷胱甘肽的影响，研究表明这2种刺激都能有效增加谷胱甘肽的产量。在氧化刺激中，发酵后21h添加0。012gL的高锰酸钾，谷胱甘肽的产量达512mgL，相比对照增产20；当过氧化氢的添加量和添加时间为30mmolL和12h，谷胱甘肽产量达482。3mgL，相比对照增产13。在高渗刺激中，发酵后15h添加15gL的KCl，谷胱甘肽的产量提升至475。2mgL。两类外源刺激物联合使用没有显示出叠加效应，相比单独使用略有下降。
　　3分离纯化
　　GSH是胞内产物，需要从细胞内GSH提取出来，提取的主要方法有细胞破碎法和抽提法。冷非凡研究了高压蒸汽提取废酵母中还原型谷胱甘肽的最佳工艺条件，利用BoxBehnken的中心组合设计及响应面法（RSM）探讨了表压、提取时间、液料比和提取次数4个因素的优化组合，通过建立二次回归模型，确定其最佳提取工艺条件为表压1。1MPa，提取时间15min，液料比101，提取次数1次，在此条件下得率最大为4。63mgg。张冰等人对酿酒酵母细胞进行微波破碎、固液分离、超滤、浓缩、离子交换层析、纳滤、大孔吸附树脂层析脱盐、结晶的工艺路线，筛选了732型强酸性离子交换树脂和DMC18型大孔吸附树脂为2步层析分离的介质，并对整个工艺进行优化，对工艺进行放大试验，考察工艺工业化可行性。工艺总收率达到70，产品纯度98。
　　4展望
　　由于谷胱甘肽众多的应用价值，因此工业化生产谷胱甘肽迫在眉睫，因此要在菌种选育方面进行研究，利用常规育种方法以及利用基因工程和代谢工程对优良菌种进行改良与开发，同时在培养基以及培养条件方面，利用现代化的数据处理方法进行优化，建立高效的产品分离纯化回收工艺，进而提高谷胱甘肽的产量。