乙酰谷酰胺注射液中有关物质的研究

　　摘 要 目的：建立HPLC法测定乙酰谷酰胺注射液中的有关物质。方法：HPLC检测采用Sepax HP-C18柱、以0.1%的高氯酸水溶液-甲醇（99 1）为流动相、检测波长为210 nm、柱温25  。 结果： 6个有关物质能较好地分离，专属性、线性、定量限、检测限、校正因子、系统精密度、溶液稳定性、重复性均符合2010年版中国药典要求，结论：该方法可将乙酰谷酰胺注射液中的乙酰谷酰胺与6个有关物质完全分离。
　　关键词 乙酰谷酰胺注射液 HPLC 有关物质
　　中图分类号：R977.9； R927.11 文献标识码：A 文章编号 ：1006-1533（2016）09-0071-05
　　Study on the relevant substance in aceglutamide injection
　　WANG Yan1*，QIAN Weigang1，LI Changwei1，XU Jinghua1，SUN Dongyan1，ZHOU Huana2，WANG Xuemin2**
　　（1. Shanghai Zhaohui Pharmaceutical Co. LTD.， Shanghai 201908， China；
　　2. Nanjing Zeheng Pharmaceutical Technology Development Co. LTD.， Nanjing 210046， China）
　　ABSTRACT Objective： To establish an HPLC method for determination of relevant substances in aceglutamide injection. Methods： HPLC was performed on a Sepax HP-C18 column with a mobile phase of 0.1% perchloric acid and methanol（99：1） at detection wavelength of 210 nm and column temperature of 25  . Results： Six relevant substances were well separated. The specificity， linearity， limit of quantitation and detection， correction factor， system precision， solution stability and repeatability were conformed to the requirements of 2010 version of Chinese Pharmacopoeia. Conclusion： Aceglutamide can be completely separated with 6 relevant substances in aceglutamide injection by this method.
　　KEY WORDS aceglutamide injection； HPLC； relevant substance
　　乙酰谷酰胺为脑功能改善药，具有改善神经细胞代谢、维持神经应激机能及降低血氨的作用[1]。临床上主要用于脑外伤性昏迷、神经外科手术等引起的昏迷、瘫痪及智力减退、记忆力障碍等适应证的治疗[2-3]。乙酰谷酰胺注射液收载于中国药典2010版，采用自身对照色谱法检测有关物质[4]，该方法仅对最大单杂质及总杂质进行限度检查；《日本药典》16版XVI Official Monographs中乙酰谷酰胺铝有关物质检测采用的是杂质外标及峰面积归一化法，该方法对杂质2-acetamidoglutarimide及总杂质进行检测[5]，但未对其它已知杂质进行定性研究。本文参考中国药典2010版二部乙酰谷酰胺注射液有关物质检查方法和《日本药典》16版XVI Official Monographs乙酰谷酰胺铝有关物质检查方法，建立了乙酰谷酰胺注射液有关物质检测方法，通过对乙酰谷酰胺原料合成工艺及乙酰谷酰胺注射液长期留样有关物质进行分析，经与有关物质对照品比较，共定性研究了6个有关物质，为乙酰谷酰胺的生产及质量控制提供了重要的依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　高效液相色谱仪（日本岛津公司），含LC-20AT泵及SDP-20AT紫外检测器及HT-230A型柱温箱（日本岛津公司）。色谱柱为Sepax HP-C18（美国赛分科技有限公司，4.6 mm 250 mm，5 μm）。乙酰谷酰胺对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100859-200501）；乙酰谷酰胺注射液（111002，111003，111004，上海朝晖药业有限公司，规格：5 ml，0.25 g）；有关物质A（谷氨酸，中国食品药品检定研究院，批号：100023-198601）；有关物质B（L-谷氨酰胺，Dr. Ehrenstorfer Gmbh惠赠，批号：10408）；有关物质C（N-乙酰-D-谷氨酰胺，自制，批号：20130110）；有关物质D（焦谷氨酸，Council of EuropeEDQM，批号：004P51）；有关物质E（N-（2，6-二氧代-3-哌啶基）乙酰胺，自制，批号：20130120）；有关物质F（N-乙酰-L-谷氨酸，自制，批号：20120917）；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为纯化水。
　　1.2 有关物质检测方法
　　参考中国药典2010版二部乙酰谷酰胺注射液有关物质检查方法和JP XVI Official Monographs乙酰谷酰胺铝有关物质检查方法，建立了HPLC方法测定乙酰谷酰胺注射液的有关物质。取本品，加流动相溶解并稀释制成每毫升中约含1 mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取1 ml，置100 ml量瓶中，加流动相稀释制成10 μg/ml的溶液，作为对照溶液；同法配置缺乙酰谷酰胺的空白辅料溶液；另精密称取乙酰谷酰胺与有关物质A、B、C、D、E、F对照品适量，加流动相制成0.2 mg・ml-1的溶液，作为对照品储备液；分别取乙酰谷酰胺及有关物质A、B、C、D、E和F对照品储备液适量，加流动相溶解并稀释成每1 ml中含有关物质A、B各10 μg，乙酰谷酰胺、有关物质C、D和F各5 μg，有关物质E 0.5 μg的溶液，作为系统适用性溶液，按相同的方法分别配制相同浓度的单个对照品溶液作有关物质定位溶液。用十八烷基硅烷键合硅胶柱（4.6 mm 250 mm，5 μm）；以0.1%的高氯酸水溶液-甲醇（99 1）为流动相；检测波长为210 nm；柱温25  ，进样量为20 μl。   2 结果
　　2.1 属性试验
　　2.1.1 空白辅料干扰试验
　　精密量取空白辅料、供试溶液及对照溶液各20 μl进样，记录色谱图，结果显示空白辅料在与对照品保留时间相同的位置上无色谱峰出现，说明空白辅料溶液对主峰无干扰。
　　2.1.2 系统适用性试验
　　取系统适用性溶液20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图，同时将各个对照品定位溶液分别取样注入液相色谱仪，定位，结果显示在该色谱条件下，能较好的对乙酰谷酰胺及其有关物质A、B、C、D、E和F进行检查，专属性较好（图1）。
　　2.1.3 破坏性试验
　　1）酸破坏产物制备 加1 mol/L盐酸溶液2.5 ml，室温放置24 h，加1 mol/L氢氧化钠溶液2.5 ml中和[6]。
　　2）碱破坏产物制备 加1 mol/L氢氧化钠溶液2.5 ml，室温放置3.5 h，加1 mol/L盐酸溶液2.5 ml中和。
　　3）高温破坏产物制备 加流动相5 ml，置恒温烘箱中，在120  条件下放置约48 h，放冷。
　　4）氧化破坏产物制备 加10% H2O2 5 ml，室温放置约48 h。
　　5）光照破坏产物制备 加流动相5 ml，4 500 Lux条件下放置约48 h。
　　结果表明，乙酰谷酰胺溶液在高温下破坏较明显、在光照条件下相对较稳定（表1）。
　　在各强制降解试验条件下，物料平衡率较好，说明该方法检出能力较好；主峰峰纯度检查中，主峰中均未检测到不纯物，说明该方法能较好地分离主峰与各降解产物（表2）。
　　2.2 线性关系
　　量取乙酰谷酰胺储备液适量，用流动相稀释制成每毫升中含乙酰谷酰胺为0.82、2.04、4.09、6.13、10.22、20.44 μg的系列溶液。精密量取上述溶液各20 μl，注入液相色谱仪。同法对有关物质A、B、C、D、E和F对照品进行线性关系研究，以浓度C（μg/ml）为横坐标，峰面积A（mAu min）为纵坐标，进行线性回归，结果显示不同对照品在不同浓度范围内显示出与峰面积较好的线性关系（表3）。
　　2.3 校正因子
　　以上述＂2.2线性关系＂项下线性曲线，计算有关物质A、B、C、D、E和F相对于乙酰谷酰胺的校正因子，结果显示：有关物质C和D校正因子在0.9 1.1范围内，可采用主成分自身对照法进行检查；有关物质A、B和F校正因子超出0.9 1.1，但在0.2 5.0范围内，可采用加校正因子的主成分自身对照法进行检查；有关物质E校正因子为0.08，可采用外标法来进行检查（表3）。
　　2.4 回收率
　　考虑到杂质E检查为外标法，考察了杂质E在乙酰谷酰胺注射液有关物质检查溶液中的加样回收率。
　　精密量取本品注射液1 ml（相当于乙酰谷酰胺50 mg），分别置于9个50 ml量瓶中，分别精密加入12.60μg/ml的有关物质E对照品溶液4 ml、2 ml、1 ml各3份，用流动相稀释至刻度，作为加样供试品溶液。精密量取20 μl进行色谱检测。按外标法以峰面积计算杂质E的测得量（扣除乙酰谷酰胺注射液中杂质E量），并计算杂质E回收率（表4）。
　　由表4可知，按外标法以峰面积测定杂质E的量，其加样回收率在86.8% 98.2%之间，各含量RSD为4.25%（n=9），表明外标法测定杂质E的准确度较高。
　　2.5 定量限与检测限
　　以10倍噪音（S/N 10）计算最低定量限，以3倍噪音（S/N 3）计算最低检测限（表5）。
　　2.6 精密度试验
　　精密量取系统适应性溶液20 μl注入色谱仪，连续进样6次，考察系统精密度。结果显示它们的峰面积无明显变化，RSD均小于10%，说明该方法系统精密度较高（表6）。
　　2.7 稳定性试验
　　取供试品溶液与对照品溶液，分别于不同时间（0、1、2、4、6、8 h）取20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图。结果显示几个有关物质和总有关物质RSD都小于2%，表明供试品溶液在室温放置8 h内稳定（表7）。
　　2.8 重复性试验
　　配制供试品溶液、对照品溶液6份，各精密量取20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，考察方法的重复性。结果显示：测定6份供试品溶液中各已知有关物质及总有关物质的量，RSD均在10%以内，说明该检查方法重复性较好（表8）。
　　2.9 样品中有关物质的测定
　　按照上述建立的乙酰谷酰胺注射液中有关物质检测方法，对乙酰谷酰胺原料、乙酰谷酰胺注射液长期留样进行测定[7]：结果显示：生产的三批注射液与原料相比，有关物质A、C、D、E、F含量有一定增加；有关物质A和E在多批次长期放置不同时间无明显增加趋势，有关物质C、有关物质和F及总有关物质逐渐增加（表9）。
　　3 讨论
　　3.1 检验方法
　　乙酰谷酰胺主峰及其各个有关物质无最大吸收，为末端吸收，在210 nm波长处均有较好的吸收，同时参考中国药典2010年版乙酰谷酰胺注射液及JP乙酰谷酰胺铝中乙酰谷酰胺的含量测定方法，选择波长210 nm为检测波长。
　　3.2 有关物质分析
　　文献[8]报道，乙酰谷酰胺在酸、碱、加热等强制降解试验条件下会产生降解杂质，其主要降解途径有：乙酰谷酰胺经水解产生N-乙酰-D-谷氨酰胺（有关物质C）及N-乙酰-L-谷氨酸（有关物质F），脱水产生N-（2，6-二氧代-3-哌啶基）乙酰胺（有关物质E），脱乙酰基产生谷氨酰胺（有关物质B）；乙酰谷氨酸脱乙酰基或谷氨酰胺水解生成谷氨酸（有关物质A），谷氨酸进一步脱水形成焦谷氨酸（有关物质D），它们的编号则是按照液相色谱图中各自保留时间的先后顺序而定。故可选用已知有关物质对乙酰谷酰胺注射液的有关物质进行分析测试[3]。
　　供试品在酸破坏试验中会降解产生有关物质，根据乙酰谷酰胺分子和文献报道判断可能发生闭合或聚合，而在有关物质检查过程中之所以采用酸性流动相溶解样品，因为从上述试验可知，供试品溶液在8 h内稳定，不会造成分析过程中有关物质增多。
　　3.3 方法验证
　　对有关物质检查方法进行方法学验证表明，该方法能较好地对本品的有关物质进行检查。与原质量标准及2015年中国药典[9]相比，该方法能使乙酰谷酰胺注射液中的乙酰谷酰胺与多达6个杂质互相分离，并可对它们进行定量检测，与2015年版中国药典关于药品质量标准分析方法验证指导原则相一致，且数据准确、可靠。
　　参考文献
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　　[2] 周昌奎， 吴哓华. 乙酰谷酰胺研究进展[J]. 海峡药学，
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　　[6] 邵仁华， 袁卫. HPLC法测定乙酰谷酰胺葡萄糖注射液中乙酰谷酰胺的含量和有关物质[J]. 齐鲁药事， 2007， 26（6）： 336-338.
　　[7] 戴飞， 洪冰， 张兴华. 乙酰谷酰胺注射液的稳定性研究[J].海峡药学， 2005， 17（4）： 25-27.
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