NaF对RAW264。7细胞活力的影响探究

　　全身暴露于过量氟（F）可导致骨稳态和牙釉质的发展受到干扰，过量氟引起的骨病变中，破骨性吸收占相当重要的位置，虽然过度破骨性吸收是氟骨症致残的一个重要因素，但对破骨细胞的活动研究很少。2012年我们采用小鼠破骨细胞前体细胞RAW264。7构建体外破骨细胞染氟模型，观察破骨细胞染氟过程中的细胞增殖和分泌特异产物基质金属蛋白酶9（matrixmetalloproteinase9，MMP9）和组织蛋白酶K（cathepsinK）表达的影响。
　　1材料与方法
　　1。1破骨细胞前体细胞RAW264。7的培养小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264。7（购自中国科学院细胞库），用含10胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基（DulbeccosmodifiedEaglesmedium，DMEM，Gibco，美国）培养液于37、5CO培养箱中培养。每3天换液一次，细胞增殖至对数生长期后，用0。25胰蛋白酶室温消化后计数备用。MMP9和组织蛋白酶K纯化多克隆抗体购于北京博奥森公司。
　　1。2破骨细胞的诱导分化及鉴定抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrateresistantacidphosphatase，TRAP）染色：RAW264。7细胞以2103个孔接种于24孔板，培养24h后用含终质量浓度为50gLRANKL和50gL小鼠重组巨噬细胞集落刺激因子（macrophagecolonystimulatingfactor，MCSF）的DMEM诱导分化剂。分别于诱导后第一、三、五和七天行TRAP染色。镜下破骨细胞呈多核巨细胞，TRAP阳性表现为酒红色颗粒。破骨细胞特异性基因检测：用免疫组织化学的方法测定诱导后的染氟细胞内基质金属蛋白酶9和组织蛋白酶K的表达，观察并用ImageProExpress图像分析软件镜下扫描灰度。
　　1。3接种细胞和分组小鼠单核巨噬细胞RAW264。7细胞浓度5104个ml接种24孔板，每孔加2ml培养基。按NaF浓度分组：对照组（NaF浓度为0mgL）占6孔板；实验组每个NaF浓度（2mgL、10mgL、20mgL、40mgL、60mgL、80mgL）占6孔板。按时间分组：对照组、实验组按时间分为24h组、48h组、72h组，分别接种6块板。
　　1。4细胞活力测定甲基偶氮唑蓝（4，5Dimethylthiazol2yl2，5diphenyltetrazoliumbromide，MTT）法测定生长抑制率。细胞悬液以5104个ml浓度接种于96孔板。每组设3个平行孔，并设空白对照。贴壁培养24h后分别加入不同处理因素，并测定不同作用时间（24、48、72h）和不同浓度F的吸光度d值。
　　1。5统计学分析采用Spss13。0软件进行统计，方差齐的多组比较采用单因素变量多因素方差分析，检验水准：0。05。
　　2结果
　　2。1NaF浓度对RAW264。7细胞活力的影响空白组（NaF浓度为0mgL）与实验组（NaF浓度为2mgL、10mgL、20mgL、40mgL、60mgL、80mgL）相比较，除NaF浓度为2mgL组与空白组比较差异无统计学意义（t7。276，P0。05）外，其余各组平均值低于空白组，差异有统计学意义（t6。74、7。32、11。87、15。93、24。38，均P0。05），表明NaF浓度对RAW264。7细胞活力有抑制作用。在受试后的48h，各实验组与空白组比较，仅60mgL（t13。14）和80mgL（t15。01）组差异有统计学意义（P0。01），其余各组与对照组（0。430。00216）相比，差异无统计学意义（t0。46，P0。05）。在受试后的72h，与对照组（0。4066670。010842）比较，仅80mgL组差异有统计学意义（t6。25，P0。01），其余各组与对照组相比，差异无统计学意义（t1。76，P0。05），见表1。
　　表1实验组和空白组在3个时间点细胞活力的比较（xs）
　　注：a。与对照组比较，P0。05；b。与对照组比较，P0。01。
　　2。2NaF浓度和作用时间对RAW264。7细胞活力的影响0mgL时，48h和72h的细胞OD值均高于24h的OD值，差异有统计学意义（t5。21、6。03，P0。05）；72h的细胞OD值低于48h的OD值，差异有统计学意义（t4。77，P0。05）。在NaF浓度为2mgL时，48h的OD值高于72h的OD值，差异有统计学意义（t9。91，P0。05）；48h和72h的细胞OD值均高于24h的OD值，即0mgL和2mgL组的3个时间OD值变化规律一致。当NaF浓度10mgL时，48h的细胞OD值均高于24h，但72h均下降，且与24h的细胞OD值比较差异无统计学意义（t0。21，P0。05）。当NaF浓度为80mgL时，3个时间点的细胞活力差异无统计学意义（t1。76，P0。05）。
　　2。3氟对体外诱导分化培养的破骨细胞MMP9和组织蛋白酶K蛋白质表达的影响氟对两种蛋白表达的影响结果见表2和表3。实验结果表明，在（1040）mgL氟浓度作用48h能使破骨细胞内MMP9升高，差异有统计学意义（t6。51，P0。05）；在24h和72h各剂量的氟对细胞内的MMP9蛋白表达与对照组比较，差异无统计学意义（t1。09，P0。05）。而氟对组织蛋白酶K的表达只在80mgL氟作用72h时，能显著降低在破骨细胞内的表达。
　　表2氟对破骨细胞MMP9蛋白质表达的影响（xs）
　　注：a。与对照组比较，P0。05。
　　表3氟对破骨细胞组织蛋白酶K蛋白质表达的影响（xs）
　　注：a。与对照组比较，P0。05。
　　3讨论
　　小鼠RAW264。7细胞作为一种单核巨噬细胞系，是体外研究破骨细胞分化的经典细胞系，因为该细胞系可以在RANKL诱导的情况下稳定分化为形态和功能均成熟的破骨细胞。本研究发现：时间与NaF浓度交互作用对RAW264。7细胞活力的影响：NaF浓度对RAW264。7细胞活力有抑制作用，但并未使细胞死亡，而是细胞活性降低。随着时间延长，细胞活性逐渐增强，说明NaF对RAW264。7细胞活力的抑制是暂时性的，随着时间的延长NaF对RAW264。7细胞活力的抑制作用在减弱。本实验未见NaF对RAW264。7细胞活力有促进作用。NaF只是暂时取代了RAW264。7细胞与活力有关的代谢因子，如果NaF浓度与此因子相当，则代谢平衡不变；如NaF浓度为20mgL（浓度高或低），与此因子浓度不相当，则暂时打破了这种平衡，但这种取代可能是可逆的，随时间延长而恢复，即NaF对RAW264。7细胞的作用是有限的。这种因子可能与RAW264。7细胞的周期活动相关的基因有关。龙丽、马雷等研究发现，氟对破骨细胞的作用剂量过低（F含量远小于1mgL），所得结果与常识不符合，很可能与选择兔细胞有关。本研究的结果与华坤、范哲和杜光等的研究基本一致，区别在本研究的剂量范围较广。氟对破骨细胞具有直接的作用，从细胞活力看，早期（24h）以损伤作用为主，但在48h显示细胞从损伤状态恢复。
　　MMP9主要在破骨细胞、骨髓单核细胞和一些骨基质表面衬细胞中表达。MMP9通过降解细胞外基质，在破骨细胞的迁移、侵蚀和锚着过程中发挥作用，应用免疫组织化学方法观察氟对培养的大鼠破骨细胞MMP9的影响，结果表明，随染氟剂量的增加，MMP9阳性细胞数逐渐增多，以10mgL、20mgL、40mgL组最为明显，与对照组比较差异有统计学意义（t6。51，P0。05）。说明氟可通过提高MMP9的蛋白质表达引起骨吸收活性的增加。
　　组织蛋白酶K（cathepsinK）属于溶酶体半胱氨酸蛋白酶中的番木瓜蛋白酶超家族成员，1999年克隆成功，又称作cathepsinO2，cathepsinX，cathepsinO。与其他组织蛋白酶不同，组织蛋白酶K具有分解骨组织中主要胶原（型胶原）的端肽区及螺旋状结构的能力发挥降解骨胶原的功能。而型胶原蛋白是含量最多的骨基质蛋白，占整个基质的90，它在骨吸收过程中发挥重要的作用。在溶骨过程中参与骨基质降解的酶主要有两种半胱氨酸蛋白酶和基质金属蛋白酶（MMPs），其中发挥主要作用的是半胱氨酸蛋白酶中的组织蛋白酶K，它选择性地大量表达于破骨细胞，其生理作用底物正是在有机骨基质中含量达95的型胶原，除此之外还能降解骨基质中的骨桥接素（osteopontin）和骨连接素（osteonectin），是破骨细胞中表达量最高、溶骨活性最强的的一种半胱氨酸蛋白酶，它对成骨胶原的降解能力远远高于其他各种MMPs，是骨吸收过程中的一个关键酶。但本研究中各浓度的氟对破骨细胞的组织蛋白酶K表达影响较小，可能不是氟作用的靶点。本研究结果尚需在动物体内实验以及人体实验中验证。