利多卡因微乳凝胶剂的制备及初步药效学探究

　　利多卡因又名赛罗卡因，可用于多种形式的局部麻醉，是一种常用局麻药，能够暂时阻断神经纤维的传导而具有麻醉作用，使疼痛阈值升高，从而缓解局部疼痛，具有起效快、穿透能力及扩散性较高、止痛作用迅速、作用时间长、刺激性较小且毒性低等特点。微乳作为一种新型给药载体，具有增加药物的溶解度、增加药物经皮渗透量、提高药物稳定性、延长药物作用时间等优点。有报道显示微乳在局部应用时能提高药物的穿透性及其皮肤深层的滞留，所以针对局部镇痛药物是一个良好的载体，但微乳流动性强，作为经皮给药载体黏附性差，依据凝胶良好的黏附性，将微乳进一步制备成微乳凝胶，可解决微乳作为经皮给药载体黏附性差、皮肤上涂展性差、滞留作用时间短等问题。本实验将利多卡因制备成微乳凝胶经皮给药制剂，并根据其临床应用，采用经典的镇痛实验，对利多卡因微乳凝胶剂的药效进行初步考察，并进一步对其皮肤刺激性进行研究。
　　1 仪器和材料
　　1.1 仪器
　　GG T1000 型电子天平(美国双杰兄弟集团有限公司);SY-1210 型数显恒温水浴槽(美国精骐集团有限公司);Zetasizer Nano-ZS90 马尔文激光粒度仪(英国马尔文仪器有限公司);日立H-7650透射电子显微镜[日立高新技术(上海)国际贸易有限公司];XS105 型分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司];DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限公司)。
　　1.2 材料与试剂
　　利多卡因原料药(武汉远成共创科技有限公司，批号：20130902，HPLC 含量：99.41%);卡波姆940(青岛天力源生物科技有限公司);盐酸利多卡因原料药(中国食品药品检定研究院，批号：100341-201403);油酸乙酯[阿拉丁试剂(上海)有限公司];聚山梨酯-80(上海凌峰化学试剂有限公司);无水乙醇(成都市科龙化工试剂厂);3%硫化钠(天津市北辰方正试剂厂);水为去离子水。
　　1.3 动物
　　ICR 小鼠， ，体质量(22.01.7)g，采购自浙江省医学科学院，许可证号：SCXK(浙)2014-0001。新西兰大白兔， 各半，体质量(2.20.1)kg，采购自浙江省农业科学院，许可证号：SCXK(浙)2010-0047。
　　2 方法
　　2.1 利多卡因微乳、微乳凝胶的制备
　　2.1.1 利多卡因微乳的制备 根据前期预试验确定了利多卡因微乳的处方和制备方法，利多卡因微乳的处方为4%油酸乙酯，15%聚山梨酯-80，9%无水乙醇，70%去离子水，2%利多卡因。按处方配比将利多卡因先加入油相油酸乙酯、表面活性剂聚山梨酯-80 和助表面活性剂无水乙醇中溶解，在室温下采用磁力搅拌器边搅拌边缓慢滴加水到含药相中，300 rmin 1 恒速搅拌至澄清透明，即得澄清透明的2%利多卡因微乳。
　　2.1.2 利多卡因微乳凝胶剂的制备 根据2.1.1项下方法制备得到微乳，然后再加入0.5%卡波姆940 至微乳中，待其充分溶胀后，搅拌均匀即得白色透明的利多卡因微乳凝胶。
　　2.2 利多卡因微乳粒径的测定和透射电镜形态观察
　　采用马尔文Zetasizer Nano-ZS90 激光粒度仪，在25  下对利多卡因微乳进行粒径及其分布测定。透射电镜形态观察：采用负染色法制备样品，滴1 滴含药微乳液滴于覆有Formvar 膜的铜网上，自然晾干30 min，再滴加2%磷钨酸1 滴，自然晾干10 min，用滤纸吸走多余的液体，置于日立H-7650 透射电子显微镜下观察微乳的形态。
　　2.3 利多卡因微乳凝胶剂对小鼠热痛模型的镇痛作用
　　ICR 小鼠经适应性饲养后，进行痛阈值的筛选。先使水浴槽水面接触热板，调节恒温装置，使水温控制在(55.00.5) ，热板恒温30 min。每次置1 只小鼠于热板上，小鼠自放在热板上至出现舔后足所需时间作为该鼠的痛阂值。剔除舔后足时间5 s 或30 s 或跳跃者。
　　将初试合格的小鼠，重新称重，随机分为6组，每组10 只，分别为空白对照组，凝胶组(2%利多卡因)，溶液组(2%盐酸利多卡因)，微乳凝胶低、中、高剂量组(利多卡因微乳凝胶含量分别为1%，2%，4%)。重复测定其正常阈值，取3 次的平均值作为该鼠给药前痛阈值。每只鼠背部剃毛约1 cm2，每只鼠给药0.15 g，空白对照组给予清水，给药后分别记录15，30，45，60，90，120 min时小鼠的痛反应(舔后足或抬后足并回头)时间，如小鼠在热板上60 s 无反应，按60 s 计算。
　　实验数据均采用x s表示，采用 SPSSl3.0 统计软件进行单因素方差分析，比较给药组均数与空白对照之间的统计学差异。
　　2.4 利多卡因微乳凝胶剂对家兔皮肤刺激性实验
　　家兔于受试前24 h 采用3%硫化钠脱去背部脊柱两侧，并以脊柱中线两侧对称。8 只兔子按 随机分为完整皮肤组与破损皮肤组。损伤皮肤组在去毛处以无菌针头划井字，以划破表皮不流血为宜，控制左右两侧皮肤的破损程度基本保持一致。试验采用同体左右侧自身对比法，家兔左侧上部涂抹4%利多卡因微乳，右侧上部为空白对照，涂抹空白微乳制剂。家兔左侧中部涂抹4%利多卡因微乳凝胶剂，右侧中部为空白对照，涂抹空白微乳凝胶制剂。家兔左侧下部为空白区，即未给药区域。
　　给药方案：采用连续7 d 给药，每只动物单笼饲养，每天取受试物0.5 mL(g)直接涂布于对应的去毛皮肤上，然后用二层纱布(2.5 cm2.5 cm)和一层玻璃纸覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定，每天贴敷给药24 h，于第8 天用温水洗去残留受试物，停药后观察3 d，每天观察涂抹部位有无红斑和水肿等情况。
　　观察指标：对于以上观察结果，按皮肤刺激反应评分标准进行刺激反应评分，皮肤刺激反应评分标准如下：无红斑0 分，轻度红斑(勉强可见)，1 分，中度红斑(明显可见)2 分，重度红斑3 分，紫红色红斑到轻度焦痂形成4 分;无水肿0 分，轻度水肿(勉强可见)1 分，中度水肿(明显隆起)2分，重度水肿(皮肤隆起1 mm，轮廓清楚)3 分，严重水肿(皮肤隆起1 mm 以上并有扩大)4 分，最高总分值8 分。计算出各组平均分后，按皮肤刺激强度评分标准进行皮肤刺激强度评价，皮肤刺激强度评分标准如下：0~0.49，无刺激性;0.5~2.99，轻度刺激性;3.0~5.99，中度刺激性;6.0~8.0，强刺激性。
　　3 结果
　　3.1 利多卡因微乳的粒径与外观
　　按2.2项下方法测得利多卡因微乳的粒径100 nm，采用激光粒度仪测得的平均粒径为(66.8316.27)nm，聚分散指数为0.1180.025，粒径分布图。利多卡因微乳电镜照片，可见，所得的微乳形态规整，几呈球形，粒径多在70 nm 左右。
　　3.2 利多卡因微乳凝胶剂对小鼠热痛模型的镇痛作用
　　利多卡因微乳凝胶剂各剂量组均能明显抑制热板所致的小鼠足痛，延长痛阈值，微乳凝胶中、高剂量组在15，30，45，60，90 min 时，与空白对照组和溶液组比较差异均具有统计学意义(P0.05)，其中在45 min 和60 min 时与凝胶组比较，差异均具有统计学意义(P0.05)。
　　3.3 利多卡因微乳凝胶剂对家兔皮肤刺激性影响按2.4 项下皮肤刺激反应评分标准评价，观察家兔涂抹部位的红斑和水肿情况，各组皮肤评分及强度评分结果。利多卡因微乳对正常完整皮肤有轻度刺激性，利多卡因微乳凝胶剂对正常完整皮肤没有刺激性，利多卡因微乳及微乳凝胶对破损皮肤均有轻度刺激性。
　　4 讨论
　　本研究通过踏板法实验来考察利多卡因微乳凝胶制剂的镇痛作用。镇痛实验表明，低、中、高剂量的微乳凝胶均能剂量依赖性地提高小鼠痛阈值，并且在相同给药量下，中、高剂量的微乳凝胶在45 min 和60 min 时与空白对照组、凝胶组(2%利多卡因)、溶液组(2%盐酸利多卡因)比较差异均具有统计学意义(P0.05)，以上结果表明中、高剂量的微乳凝胶的镇痛效果较凝胶好。这主要由于微乳凝胶不仅提高了微乳的黏度，改善微乳与皮肤的黏附性和涂展性，还增加了局部滞留时间和药物的经皮渗透量。
　　皮肤刺激性实验结果表明，高剂量的微乳对正常完整皮肤有轻度刺激性，高剂量的微乳凝胶对正常完整皮肤没有刺激性，但高剂量的微乳及微乳凝胶对破损皮肤均有轻度刺激性，这表明利多卡因微乳凝胶有更好的安全性。原因是微乳凝胶可克服微乳因水分易蒸发导致表面活性剂浓度升高，皮肤刺激性增强。
　　综上所述，利多卡因微乳凝胶局部外用制剂表现出较好的镇痛作用，表明利多卡因经皮吸收效果良好，开发其为一种局部经皮给药制剂具有一定的临床应用价值。