黄芩素抗肿瘤机制的研究现状及最新进度

　　传统中药用于肿瘤治疗的研究在全世界引起了越来越多的关注，其中黄酮类化合物黄芩素具有广泛的生物学活性及药理作用，其抗肿瘤的作用机制更是近年来国内外的研究热点。有关多种肿瘤的体内外实验均证实黄芩素可通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡，抑制肿瘤血管新生，调节侵袭转移相关分子表达及信号通路活性等途径发挥抗肿瘤作用，有望成为安全、价廉且广谱的有效抗肿瘤药物。
　　1黄芩素简介
　　黄芩是唇形科多年生草本中药植物黄芩（ScutellariaBaicalensisGeorgi，SBG）的干燥根，属我国大宗中药材，药用历史悠久，传统中医认为具有清热燥湿、泻火解毒、凉血、安胎等功效，目前仍是一味被广泛应用于临床的中药，对呼吸道感染、腹泻痢疾、病毒性肝炎、过敏性疾病和妇科疾病都有一定疗效。黄芩素（Baicalein，BAI）又叫黄芩苷元、黄芩黄素，在黄芩生药中占5。41，是从黄芩的干燥根中提取的主要有效成分，也是黄芩发挥药理作用的物质基础。黄芩素的分子式为C15H10O5，分子量为270。24，化学结构见。黄芩素属于黄酮类化合物，研究表明黄芩素具有多种药理作用，如抗菌、抗病毒、抗炎、抗变态反应、抗氧化、清除氧自由基、抗凝、抗血栓形成、抗肿瘤和保护肝脏、心脑血管、神经元等作用。其抗肿瘤作用机制成为近年来中药抗肿瘤研究领域的热点问题。
　　2黄芩素抗肿瘤作用的研究
　　进展目前研究较深入的黄芩素抗肿瘤机制包括通过多种途径诱导肿瘤细胞凋亡，诱导肿瘤细胞增殖周期停滞，抑制肿瘤细胞增殖，调控细胞凋亡相关基因蛋白的表达、抑制肿瘤血管生成，清除自由基及抑制端粒酶活性等。近年来，黄芩素抗肿瘤侵袭转移的作用机制成为了新的研究热点，大量研究表明，黄芩素通过多种途径抑制恶性肿瘤的侵袭转移。
　　2。1黄芩素诱导肿瘤细胞凋亡
　　程序性细胞死亡（programmedcelldeath）即凋亡（apoptosis），是在胚胎发育及维持组织稳态的过程中清除不需要的、受损、老化以及异位细胞的进化保守的过程。对凋亡的抵抗使多余的、自身特异性或遗传变异细胞异常存活，可导致如自身免疫性疾病及肿瘤的发生。细胞凋亡不仅与肿瘤的发生、发展密切相关，也是调节肿瘤细胞转移的重要机制。细胞凋亡在多个环节调控肿瘤的转移过程，通过调节肿瘤转移过程中的三个步骤来影响转移效率：
　　细胞凋亡调控转移的起始过程：正常来源的上皮或内皮细胞通常在脱离相邻细胞或ECM后发生程序性死亡，这种细胞死亡程序被称为失巢凋亡（Anoikis）。
　　机体免疫监控及机械应激调控循环肿瘤细胞的凋亡。
　　凋亡发生在靶器官微转移过程中。许多研究表明，黄芩素通过多种途径促进肿瘤细胞凋亡。
　　2。1。1黄芩素抑制12LOX诱导细胞凋亡
　　花生四烯酸（arachidonicacid，AA）为磷酸酯酶分解细胞膜磷脂而释放，三种酶能够将花生四烯酸代谢为生物学活化的类花生酸类，包括环加氧酶（cyclooxygenases，COX），环氧化物酶（epoxygenases）即细胞色素P450（cytochromeP450）和脂氧化物酶（lipoxygenases，LOX）。这一代谢过程中产生的多种过氧化脂质及生物活性脂类具有调节细胞增殖、凋亡、分化及衰老的功能。多种LOX亚型与肿瘤的发生及进展有广泛的功能联系，其中与肿瘤关系最为密切的5LOX及血小板型12LOX（platelettype12LOX）通常在正常上皮不表达，而在包括结肠癌、食管癌、肺癌、前列腺癌及乳腺癌等上皮肿瘤中都存在组成性表达。黄芩素是12LOX的选择性抑制剂。Pidgeon等对非小细胞肺癌的研究发现，黄芩素处理A549腺癌细胞能诱导近40的肿瘤细胞凋亡，鳞状肺癌细胞系SKMES1对12LOX抑制剂更加敏感。黄芩素呈时间依赖性抑制胃癌细胞增殖，但12LOX活性代谢产物12HETE（12hydroxyeicosateraenoicacid）逆转了黄芩素的作用。黄芩素对人恶性黑色素瘤细胞也具有增殖抑制和凋亡诱导作用，westernblot结果显示，黄芩素呈时间及剂量依赖性抑制RPMI8226细胞12LOX的表达。
　　2。1。2黄芩素通过调节PI3KAkt通路诱导凋亡
　　磷脂酰肌醇3激酶（thephosphatidylinositol3kinase，PI3K）由独特且保守的能够将磷脂酰肌醇及磷肌醇类的3羟基基团磷酸化的细胞内脂质激酶组成。PI3K的功能活化参与包括细胞增殖、凋亡、存活、细胞骨架重构、蛋白合成及肿瘤生长等一系列细胞生物学过程，并涉及不同细胞外信号通路的作用。Akt即蛋白激酶B（proteinkinaseB），是一种底物种类广泛的丝氨酸苏氨酸激酶。Akt是PI3K信号通路主要的下游靶点之一，能够调节包括细胞增殖、凋亡、生长及肿瘤发生在内的许多生物学过程。Zhang等研究发现，黄芩素能显著抑制食管鳞癌细胞的增殖并促进细胞凋亡，而这一作用与黄芩素抑制PI3KAktNFB和PI3KAktmTOR信号通路相关。在表皮样癌A431细胞、膀胱癌和结肠癌细胞的研究中也观察到黄芩素诱导肿瘤细胞凋亡的作用与下调PI3KAkt通路有关。
　　2。1。3黄芩素通过线粒体通路诱导凋亡
　　线粒体依赖的凋亡途径是最重要的凋亡诱导途径之一。Bcl2家族蛋白是这一内源性凋亡通路的主要调节因子，能够促进或抑制细胞色素C及其他凋亡蛋白释放时线粒体外膜通透性的变化。若促进线粒体膜孔形成则多种促凋亡因子由膜间腔释放入胞质溶胶中，进而激活caspases，诱导细胞凋亡。对不同肿瘤的研究结果显示，黄芩素诱导肿瘤细胞凋亡与其调节线粒体凋亡途径相关。黄芩素对胰腺癌有显著的抑制作用，用黄芩素处理人胰腺癌细胞后，抗凋亡蛋白Bcl2和Mcl1表达水平降低，促凋亡蛋白Bax表达水平上调；黄芩素能够诱导细胞色素C的释放及caspase9活化，两者均为凋亡通路的关键信号分子。Leung等研究发现，黄芩素诱导人非小细胞肺癌细胞系H460凋亡的同时伴随着抗凋亡蛋白Bcl2表达的降低和促凋亡蛋白Bax表达水平的升高。在骨髓瘤的研究中发现黄芩素能够降低线粒体膜电位，激活caspase9和caspase3，提示其诱导骨髓瘤细胞凋亡的机制涉及线粒体介导的凋亡信号通路。黄芩素对人肝癌J5细胞凋亡的诱导也与线粒体依赖的caspase活化通路相关。
　　2。1。4黄芩素通过激活caspase3并促进PARP裂解诱导肿
　　瘤细胞凋亡聚腺苷二磷酸核糖聚合酶〔Poly（ADPribose）（PAR）polymers，PARP〕是能够将NAD裂解为烟酰胺及ADPribose，在多种与染色质相关的受体蛋白谷氨酸残基部位形成长且分支的腺苷二磷酸核糖聚合物的酶家族的统称。PARP的功能涉及有丝分裂、DNA修复机制、转录控制及caspase依赖的细胞死亡过程。PARP剪切被认为是细胞凋亡的一个重要指标，也通常被认为是Caspase3激活的指标。PARP对于细胞的稳定和存活非常重要，剪切后的PARP失去其酶活力，细胞的不稳定增加。近年来的研究发现，PARP本身是一种细胞死亡诱导信号，PARP信号异常与多种疾病的发生、发展有密切联系，药物干预PARP相关的蛋白及死亡信号有望成为新的治疗途径。KimSJ等研究发现，黄芩素能够显著诱导结直肠癌HT29细胞线粒体损伤及凋亡，调节Bcl2和Bax蛋白的表达，引起线粒体功能障碍，同时引发凋亡性DNA片段化，caspase活化及PARP的裂解。食管鳞状上皮细胞癌细胞系经黄芩素处理后出现DNA片段化，凋亡数量明显增加，促凋亡蛋白Bax，活化的caspase3、caspase9及裂解的PARP表达明显增加，同时伴随着caspase3及caspase9前体（procaspase3，procaspase9）以及非裂解的PARP表达的减少。提示黄芩素介导的食管鳞癌细胞的凋亡是通过以下步骤完成：procaspase9裂解，procaspase3裂解，导致PARP的裂解，最终引起DNA降解。在一项前列腺癌的研究中，黄芩素能够显著抑制肿瘤细胞的生长，促进凋亡重要标志物PARP1的裂解。上述研究提示黄芩素可能通过抑制PARP诱导肿瘤细胞凋亡。
　　2。2黄芩素诱导肿瘤细胞周期停滞抑制细胞增殖
　　细胞周期参与细胞生长、增殖，器官发育，DNA损伤修复调节，损伤后组织增生及如肿瘤等疾病的发生、发展，是一种普遍存在的复杂过程。在肿瘤的发生及进展过程中，因直接影响细胞周期的癌基因或抑癌基因，如pRb、p53、p21、p16和cdc25等的表达及功能异常导致细胞周期调节异常，新生组织增殖速率加快，出现不依赖生长信号刺激的异常增殖，肿瘤细胞生长失去控制，分化异常，导致肿瘤持续进展。黄芩素通过调节不同类型的细胞周期蛋白（cyclins）和细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclindependentkinase，CDKs），抑制细胞周期进展从而抑制细胞增殖。细胞周期分析显示，经黄芩素处理后，S期的NSCLC细胞数量减少，黄芩素诱导S期停滞的同时，抑制了调节S期向G2M转换的CDK1和cyclinB1的表达。黄芩素部分通过激活ERK信号而抑制cyclinB1的表达，诱导5637膀胱癌细胞S期停滞；同时有效降低cyclinD1的表达而迅速在G1期抑制细胞周期进展。在骨肉瘤研究中，黄芩素并通过下调cyclinD1和CDK4的表达诱导细胞停滞于G1期。黄芩素处理结直肠癌细胞后，观察到有效的S期停滞和促凋亡效应。分子水平研究发现黄芩素诱导caspase3和9的活化。
　　2。3黄芩素抑制肿瘤血管新生
　　血管新生指由组织中既存的成熟血管的内皮细胞发生增殖和游走，从已有的血管分支形成新的小血管而使血管网络得以扩张。异常及不受机体控制的血管新生促进了实体肿瘤的快速生长及转移。
　　2。3。1黄芩素抑制VEGF诱导的肿瘤血管新生
　　血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）及其受体VEGFR是参与血管新生的主要功能蛋白。VEGF是内皮细胞生长及存活所必需的细胞因子之一，通过VEGF受体（VEGFreceptor，VEGFR）2（VEGFR2）依赖性信号通路诱导个体发育过程中的血管新生，也是肿瘤细胞为促进内皮细胞增殖所分泌的主要促血管新生的因子，与肿瘤进展关系密切。研究表明，黄芩素能够通过抑制VEGF诱导的血管新生及内皮细胞增殖来发挥其抗肿瘤作用。Ling等发现黄芩素能抑制人脐静脉血管内皮细胞（humanumbilicalvascularendothelialcells，HUVECs）的迁移能力及小管形成能力，抑制VEGF诱导的新生血管的生长。黄芩素干预后使得调节内皮细胞增殖的两种关键信号通路成员磷酸化，VEGFR2及ERK表达减少。经细胞周期分析发现，黄芩素处理后HUVECs停滞于G1S期，黄芩素还能抑制cyclinD、cyclinE、cdk4、cdk6和pRb等具有促进细胞周期从G1期向S期转变功能的G1期相关蛋白表达的减少。而p16、p21、p27和p53等几个cdks和cyclins的上游蛋白表达被黄芩素上调，提示黄芩素可能部分通过作用于p53Rb信号通路来抑制血管新生。
　　2。3。2黄芩素下调基质金属蛋白酶抑制肿瘤血管新生大量
　　研究都对IV型胶原酶基质金属蛋白酶2（MatrixMetalloproteinases2，MMP2）和MMP9在肿瘤血管新生中的作用进行了探讨。在一个管腔形成实验模型中，当HUVECs形成管样结构时MMP2表达增多，且能被金属蛋白酶组织抑制剂（tissueinhibitorofmetalloproteinase，TIMP）l或TIMP2所抑制。一项关于T细胞源性血液肿瘤蕈样肉芽肿病的研究发现，随着肿瘤的进展，肿瘤微血管密度增加，同时伴随着MMP2和MMP9表达水平的增高。研究者通过给瑞氏白化变种小鼠饲喂苯并芘（benzo（a）pyrene，B（a）P）建立小鼠肺癌模型，发现B（a）P诱导的模型组较正常对照组及黄芩素用药组MMP2、MMP9和COX2蛋白表达水平显著升高。B（a）P诱导前或诱导后的黄芩素给药处理组这三种蛋白表达水平均显著下降。上述结果提示黄芩素可能通过抑制MMP2、MMP9和COX2的表达从而抑制肿瘤血管新生〔46〕。Liu等〔47〕用黄芩素处理鸡胚绒毛尿囊膜（chickembryochorioallantoicmembrane，CAM）48小时后，基本成纤维细胞生长因子（basicfibroblastgrowthfactor，bFGF）诱导血管新生的作用受到抑制。黄芩素呈浓度依赖性抑制HUVECsMMP2的活性。上述研究结果均提示下调MMPs可能是黄芩素抑制肿瘤血管新生的机制之一。
　　2。3。3黄素抑制炎症反应诱导的肿瘤血管新生
　　血管新生过程对炎症反应及肿瘤进展而言都是必不可少的生物学步骤。近年来，炎症与肿瘤的关系得到越来越多研究者的关注。炎症反应改变了血管的通透性，激活内皮细胞及血管重建机制。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作为革兰阴性菌细胞壁的成分，能对机体产生强有力的炎性刺激。许多血管新生模型的相关研究显示LPS具有成血管活性，LPS在体内也具有促进肿瘤血管新生的作用。黄芩素的抗炎作用是其抗肿瘤机制之一。Ling等研究发现，黄芩素在体内及体外实验中均能显著抑制LPS诱导血管新生的作用。黄芩素抑制了LPS诱导的大鼠主动脉环新生血管芽的形成，并且干扰了LPS刺激HUVECs在体外的小管形成能力。研究显示LPS刺激内皮细胞诱导血管新生的作用是通过激活Toll样受体4（tolllikereceptor4，TLR4）介导的肿瘤坏死因子受体香菇那因子6（TNFreceptorassociatedfactor6，TRAF6）依赖性信号通路的作用而实现。Westernblot实验结果显示，黄芩素抑制LPS诱导血管新生的作用机制与其下调LPSTLR4TRAF6通路部分相关。
　　2。4黄芩素抑制肿瘤侵袭转移过程
　　侵袭性与转移能力是恶性肿瘤的重要生物学特征，它涉及到全身各系统、多脏器，严重影响肿瘤患者的疗效和预后，是导致患者肿瘤复发、病情恶化而最终死亡的病理基础。肿瘤转移是多因素参与、多步骤进行、渐进性发展的复杂的动态过程。许多体内外研究表明，黄芩素能够显著抑制乳腺癌、肝癌等肿瘤细胞的侵袭转移，其抗肿瘤转移的作用及其机制成为近年来的研究热点。
　　2。4。1黄芩抑制肿瘤细胞从原发肿瘤脱落
　　肿瘤细胞脱离原发肿瘤灶是肿瘤转移的前提及初始步骤，为其侵入周围组织并进入血管、淋巴管或者体腔，最终形成转移灶提供了必要条件，是肿瘤转移过程中的关键环节。研究发现，4T1小鼠乳腺癌细胞球体逐渐增大的过程中伴随着降解细胞外基质的主要基质金属蛋白酶MMP9表达的增加，同时活性氧分子（reactiveoxygenspecies，ROS）的产生也明显增多；黄芩素干预后，4T1小鼠乳腺癌细胞生长停滞，ROS的产生及MMP9的表达也受到抑制，同时观察到4T1小鼠乳腺癌细胞从肿瘤细胞球上脱落及侵入胚胎干细胞来源的血管化组织的能力降低。上述实验结果提示下调MMP9表达和抗氧化是黄芩素抑制肿瘤细胞从原发瘤灶脱落及侵袭的可能作用机制。
　　2。4。2黄芩素下调MMP2、MMP9及uPA的表达
　　穿越正常生物学屏障是肿瘤转移过程中的关键步骤。MMPs和纤溶酶原激活物（plasminogenactivator，PA）等能够降解细胞外基质及基底膜成分的蛋白酶类在肿瘤侵袭转移过程中起到重要作用〔56，57〕。一般认为与肿瘤侵袭、转移关系最密切的蛋白水解酶类是MMP2，MMP9和uPA。丝氨酸蛋白酶uPA也具有强大的降解细胞外基质的功能，并能激活多种MMPs前体，促进肿瘤侵袭转移及血管新生。
　　Chiu等发现，用黄芩素能显著抑制肝癌SKHep1细胞MMP2、MMP9和uPA的活性。用黄芩素和ERK抑制剂分别处理肝癌细胞后均显著降低了细胞的侵袭能力，同时MMP2、MMP9和uPA蛋白的表达水平也受到抑制，而MMPs抑制因子TIMP1和TIMP2蛋白表达水平显著增高。提示黄芩素可能通过抑制ERK通路活性而发挥其下调MMP2、MMP9和uPA，同时上调TIMP1和TIMP2表达水平的功能。Wang等发现，黄芩素呈浓度依赖性抑制乳腺癌MDAMB231细胞迁移及穿越基质胶的侵袭能力，与其下调MMP29的表达相关。膀胱癌及骨肉瘤的相关研究也提示黄芩素可能通过抑制MMP29的活性而抑制肿瘤细胞的侵袭转移。
　　2。4。3黄芩素抑制埃滋蛋白的表达和活化
　　埃兹蛋白根蛋白膜突蛋白（ezrinradixinmoesin，ERM）是细胞内连接肌动蛋白丝与胞膜的重要分子，参与亚细胞骨架构建和接触识别等重要功能。作为细胞骨架与细胞质膜的联结者，ezrin的表达及其生物学功能的发挥还参与了肿瘤转移相关细胞骨架及细胞表面蛋白分子之间的信号转导，使细胞骨架重塑，与恶性肿瘤细胞的生长和转移潜能密切相关。在胃癌、乳腺癌、原发性肝细胞肝癌等组织标本中存在着ezrin的异常高表达，且与肿瘤的恶性程度、侵袭转移及不良预后密切相关。伍斌等观察到黄芩素呈剂量依赖性地抑制皮肤鳞癌细胞爬行运动及侵袭能力，抑制A431细胞ezrinmRNA及蛋白的表达。此外，黄芩素处理以后A431细胞的所有生物学行为的改变都与ezrinsiRNA处理后的结果一致，提示黄芩素很大程度上是通过直接或间接抑制ezrin蛋白表达及其磷酸化而抑制A431细胞的侵袭运动能力。任学群等对人胰腺癌的研究发现，黄芩素可能通过下调ezrin表达及其磷酸化活化而抑制PANC1细胞的增殖和运动侵袭能力。对人原发性肝癌的研究也得出了类似的结论。上述实验结果均支持黄芩素抑制肿瘤细胞恶性增殖及运动侵袭能力可能与其抑制肿瘤细胞ezrin表达及活化有关的观点。
　　2。4。4黄芩素调节多种侵袭转移相关信号通路活性
　　肿瘤侵袭转移是多种信号网络中不同环节的相关分子表达或功能改变所导致的信号通路功能异常活化或抑制的结果。近年来，研究者们对黄芩素抗肿瘤转移机制的研究不断深入，得以在分子水平上揭示越来越多新的黄芩素作用靶点。Chen等对肝细胞肝癌进行体内外研究发现，黄芩素显著抑制磷酸化MEK1和ERK12的水平。MEK1过表达部分阻断了黄芩素的抗转移作用；黄芩素与ERK抑制剂U0126联合起到了协同性抗侵袭作用，从而得到黄芩素抗肿瘤侵袭转移的分子机制与抑制ERK通路相关的结论。另一项肝癌的研究中，黄芩素通过下调PKC和p38MAPK活性而阻断肿瘤侵袭转移通路。对卵巢癌、胃癌和胶质瘤的研究也发现黄芩素通过下调p38MAPK依赖性NFB通路信号而抑制MMP2的表达和肿瘤侵袭能力。MAPKMMP信号通路功能异常是乳腺癌侵袭转移的分子机制之一，Wang等研究发现经黄芩素处理后，乳腺癌MDAMB231细胞内磷酸化Akt、ERK、JNK和P38表达水平下降，提示黄芩素通过下调MAPK信号抑制MMP29的表达，从而发挥抗转移作用。新近文献报道，黄芩素通过下调caveolin1AKTmTOR信号通路而抑制雄激素非依赖性前列腺癌细胞转移。近来血小板活化和肿瘤转移的相关性得到普遍认识，黄芩素能够抑制激动剂和肿瘤细胞诱导的血小板聚集，并抑制肺肿瘤转移。其机制与黄芩素增强cAMP介导的血管扩张剂刺激磷蛋白（vasodilatorstimulatedphosphoprotein，VASP）磷酸化以及干扰MAPKs和PI3KAkt信号活性相关。此外，黄芩素干扰17雌二醇（17estradiol，E2）诱导的G蛋白耦联雌激素受体（GPR30）相关信号功能，包括抑制EGFR酪氨酸磷酸化以及ERK和丝苏氨酸激酶Akt磷酸化，同时还下调结缔组织生长因子（connectivetissuegrowthfactor，CTGF）、cysteinerich61（CYR61）等GPR30靶基因的表达，提示黄芩素通过改变GPR30信号通路活性而抑制E2诱导的乳腺癌细胞转移。
　　3小结与展望
　　传统中药用于肿瘤治疗的研究在全世界引起了越来越多的关注，其中黄酮类化合物黄芩素具有广泛的生物学活性及药理作用，其抗肿瘤的作用成为更是近年来国内外的研究热点。以国人为主导的国内外研究团队们投入大量经费及心血不断深入对黄芩素抗肿瘤分子机制的研究，为使黄芩素成为安全、价廉且广谱的有效抗肿瘤药物而不懈努力。最近的研究提出了一些新颖的观点，包括黄芩素能够促发肿瘤细胞自噬性死亡，其机制与抑制AKTmTOR、AMPKULK1通路相关。Liu等首次提出黄芩素通过下调X染色体耦联锌脂蛋白（ZincfingerproteinXlinked，ZFX）的表达而抑制膀胱癌细胞生长及转移。本课题组首次发现黄芩素对乳腺癌MDAMB231细胞的侵袭抑制作用与其下调基因组织者SATB1的表达相关。丰富的研究成果充分展示出黄芩素巨大的抗肿瘤潜能。黄芩素的抗肿瘤作用机制亟待深入研究，为其进入临床实验并最终应用于临床肿瘤治疗提供更为确切的理论依据。