谈RPHPLC法同时测定白头翁汤中8种成分何

　　白头翁汤是中医临床常用的经典方剂，由白头翁、黄连、黄柏、秦皮组成，对多种原因引起的热毒血痢有较好疗效。由于中药复方成分复杂，故制定科学合理的相关质量标准难度较大，目前大多以所含主要指标成分的含有量为依据，指标成分设定的越多，对制剂质量的评价就越准确客观，反之则科学性就越差。文献以白头翁汤中个别指标成分为标准，或者通过TLC法进行定性，但定性鉴别只能解决各组成药材的真伪问题，对个别指标成分含有量的测定也不能全面评价该制剂的质量。本研究建立RPHPLC法同时测定白头翁汤中8种指标成分（秦皮甲素、黄柏碱、秦皮乙素、表小檗碱、巴马汀、黄连碱、盐酸小檗碱和白头翁皂苷B4）的含有量，旨在为该制剂质量标准的制定提供更科学的实验依据。
　　1材料与仪器
　　1。1药品与试剂盐酸小檗碱（201212）、黄连
　　碱（201112）、巴马汀（201510）、表小檗碱（201007）、秦皮甲素（201204）、秦皮乙素（201107）和白头翁皂苷B4（201101）对照品均购自中国食品药品检定研究院。白头翁、黄柏、黄连、秦皮均购自合肥乐家老铺中药饮片有限公司，经安徽科技学院食品药品学院时维静教授鉴定为正品。甲醇、乙腈为色谱纯（美国J。T。Baker公司）；磷酸二氢钾、十二烷基磺酸钠为色谱纯（美国ACS恩科化学公司）；磷酸为色谱纯（美国Fisher公司）。
　　1。2仪器Agilent1100液
　　相色谱仪（配置G1379A型自动脱气机、G1311A型四元泵、G1313A型自动进样器、G1316型柱温箱、G1312A型可变波长紫外检测器和色谱工作站）、ZOBAX色谱柱（美国安捷伦公司）；BSA224S分析天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；GenpureUVWC实验室超纯水系统（美国Thermo公司）；XHD涡旋振荡器（无锡沃信仪器有限公司）。
　　2方法与结果
　　2。1标准溶液配制精密称取盐酸小檗碱1。4mg、表小檗碱1。0mg、巴马汀1。1mg、黄连碱1。4mg、黄柏碱1。7mg、秦皮甲素1。3mg、秦皮乙素1。5mg、白头翁皂苷B41。0mg，置于10mL量瓶中，甲醇定容，即得。
　　2。2供试品溶液制备按药典组方及比例称取白头翁、黄柏、黄连和秦皮适量，去离子水常规水提，定容至100mL，得白头翁汤水提液供试样品，同法制备3批。从中吸取1mL，置于10mL量瓶中，乙腈定容，0。22m微孔滤膜过滤，即得。
　　2。3阴性溶液制备按组方比例，制备缺白头翁、秦皮、黄连、黄柏的阴性样品。从中吸取1mL，置于10mL量瓶中，乙腈定容，0。22m微孔滤膜过滤，即得。
　　2。4流动相确定采用多波长梯度洗脱方式进行测定。考擦了乙腈磷酸、甲醇磷酸流动相系统，将流动相B（乙腈）和流动相D（0。1磷酸，pH3。7）以不同比例梯度洗脱，得到分离度较好、时间较短的洗脱程序；体积流量0。7mLmin；进样量10柱温30。
　　2。5检测波长确定根据《中国药典》，各成分的最大吸收波长约为300nm左右。故本研究选择300nm波长，然后单独进样以逐个考察该成分出峰时间，最后确定波长变化程序。
　　2。6液相色谱条件确定梯度洗脱（010min，56乙腈；1015min，625乙腈；1545min，2535乙腈），检测波长315nm（018。5min）、284nm（18。520min）、315nm（2025min）、345nm（2540min）、210nm（4060min）；体积流量0。7mLmin；柱温30；进样量10L。
　　2。7HPLC检测HPLC色谱图。各成分保留时间分别为秦皮甲素17。05min、黄柏碱19。25min、秦皮乙素21。52min、表小檗碱25。35min、巴马汀26。31min、黄连碱29。74min、盐酸小檗碱31。35min、白头翁皂苷B442。83min，分离度良好，阴性无干扰。
　　2。8系统性试验
　　2。8。1线性关系考察取标准品溶液母液各50L，置于1。5mL离心管中，氮吹仪挥干，定容至1mL，倍比稀释后分别得到5个梯度的混合标准品溶液，在2。2项色谱条件下测定。以质量浓度为纵坐标（Y），峰面积为横坐标（X）进行线性回归，得到各标准物质的标准曲线，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。
　　2。8。2精密度试验
　　2。8。2。1日内精密度于制备后第0、2、4、6、8、12h精密吸取高、中、低3个质量浓度的混合对照品溶液，在上述色谱条件下测定。结果，秦皮甲素、黄柏碱、秦皮乙素、表小檗碱、巴马汀、黄连碱、盐酸小檗碱、白头翁皂苷B4峰面积RSD分别为0。280。41、0。380。42、0。410。69、
　　2。8。2。2日间精密度于制备后第1、2、3、4、5天精密吸取高、中、低3个质量浓度的混合对照品溶液，在上述色谱条件下测定。结果，秦皮甲素、黄柏碱、秦皮乙素、表小檗碱、巴马汀、黄连碱、盐酸小檗碱、白头翁皂苷B4峰面积RSD分别为0。460。73、0。510。72、0。200。61、0。451。18、0。421。03、0。611。61、0。281。17、0。430。51，表明仪器精密度良好。
　　2。8。3重复性试验按2。2项下方法制备供试品溶液5份，在上述色谱条件下进样，测得秦皮甲素、黄柏碱、秦皮乙素、表小檗碱、巴马汀、黄连碱、盐酸小檗碱、白头翁皂苷B4峰面积RSD分别为2。12、2。41、2。09、1。94、2。17、2。47、1。82、1。47，表明该方法重复性良好。
　　2。8。4稳定性试验取同一供试品溶液，每隔4h在上述色谱条件下测定，共6次，测得秦皮甲素、黄柏碱、秦皮乙素、表小檗碱、巴马汀、黄连碱、盐酸小檗碱和白头翁皂苷B4峰面积RSD分别为0。37、0。52、0。63、0。39、0。46、0。32、1。24、1。08，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
　　2。8。5加样回收率试验取各成分含有量已知的供试品6份，每份1mL，精密加入盐酸小檗碱（17。5g）、黄连碱（17。5g）、巴马汀（27。5g）、表小檗碱（25g）、秦皮甲素（32。5g）、秦皮乙素（37。5g）、黄柏碱（42。5g）、白头翁皂苷B4（25。0g）对照品溶液，定容，在上述色谱条件下测定，计算回收率。
　　2。9含有量测定将供试品溶液于第1、3、5天进样测定。结果，均符合药典要求（表小檗碱、黄连碱、巴马汀以及盐酸小檗碱相对于全方的含有量分别为0。8、1。6、1。5、1。6和5。5，秦皮甲素和秦皮乙素之和超过1。0，白头翁皂苷B4为4。6，黄柏碱为0。34）。
　　3讨论和结论
　　白头翁汤源自《伤寒论》，具有清热解毒、凉血止痢之功效，主治热毒痢疾，临床常用于阿米巴痢疾、细菌性痢疾等疾病的治疗，而且因其以临床疗效好、毒副作用小、在肉食品中残留少等优势，还被广泛用于动物各种细菌性、病毒性疾病的治疗。随着中药现代化发展，白头翁汤在传统汤剂的基础上推陈出新，出现了散剂、灌肠剂、结肠缓释片、颗粒剂等多种新剂型。
　　因此，建立一套科学完善的白头翁汤质量检测标准显得尤为必要。本实验考察了乙腈磷酸、甲醇磷酸、乙腈三乙胺流动相系统对成分测定的影响，发现甲醇磷酸、乙腈三乙胺系统均会对测定造成干扰，推测三乙胺紫外吸收波长较大，造成负吸收，严重干扰基线，导致基线不平，从而干扰定量结果，故选择乙腈磷酸系统，并以适量三乙胺调节pH。同时，对不同体积比例下的色谱图进行比较，发现当乙腈所占比例为50时，各成分保留时间均在30min以上，分离度较差，达不到测定要求；为30左右时，虽然缩短了大多数成分的保留时间，但分离度仍达不到定量要求，故最终采用梯度洗脱检测法，在此条件下各成分分离度良好，无相互干扰。本研究建立RPHPLC法同时测定白头翁汤中8种指标成分（秦皮甲素、黄柏碱、秦皮乙素、表小檗碱、巴马汀、黄连碱、盐酸小檗碱和白头翁皂苷B4）的含有量，通过方法学考察，表明该方法准确可靠，所得各成分分离度较好，能够满足定量测定要求。