中国药典黄曲霉毒素检测过程有关问题解析

　　黄曲霉毒素( aflatoxin，AF) 是由黄曲霉( asperillusflavus) ，寄生曲霉( asperillus parasiticus) 等真菌产生的一类分子结构相似的次级代谢产物，是一类毒性和致癌性很强的化合物，为第一类致癌物，是人类原发性肝癌的主要致病因素之一。中药材在生长和储存过程中，若环境条件适宜便会滋生霉菌从而产生黄曲霉毒素。目前黄曲霉毒素的检测方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫法、液相色谱-质谱联用法等，中国药典2010年版第二增补本采用高效液相色谱柱后衍生法测定。本文就中国药典黄曲霉毒素检验过程中常遇到的问题以及无衍生快速检测黄曲霉毒素的方法进行初步探讨。
　　1 仪器与试药
　　Agilent1200 型高效液相色谱仪; Pickering Vector-PCX 柱后衍生装置; Waters 含FLR 检测器的ACQUITYUPLC H-Class 系统; SB-5200D 超声清洗器( 宁波新芝生物科技有限公司) ; K2042 高速离心机( 美国Kingdom) ; AE-100 电子天平( 瑞士Mettler) 。免疫亲和层析柱( A、B、C 公司) ; 玻璃纤维滤纸( 北京中检维康科技有限公司) ; 黄曲霉毒素混合对照品溶液( 美国SUPELCO 公司，批号: LB74656，黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1浓度分别为0.302、0.965、0.306、1.021 g /mL) 。甲醇、乙腈均为色谱纯，所用水为纯化水。地龙( 批号11008ZY04) 为汕头美宝制药有限公司提供; 陈皮( 批号110901) 为广州中一药业有限公司提供; 薏苡仁( 批号20130101B) 为广州市香雪制药股份有限公司提供; 柏子仁A、B、C 分别购自广州大参林、广州同健和广州采芝林药店，批号自编。
　　2 方法与结果
　　2.1 供试品溶液的制备
　　取本品粉末约5 g( 过二号筛) ，精密称定，加入黄曲霉毒素( aflatoxin，AF) 是由黄曲霉( asperillusflavus) ，寄生曲霉( asperillus parasiticus) 等真菌产生的一类分子结构相似的次级代谢产物，是一类毒性和致癌性很强的化合物，为第一类致癌物，是人类原发性肝癌的主要致病因素之一。中药材在生长和储存过程中，若环境条件适宜便会滋生霉菌从而产生黄曲霉毒素。目前黄曲霉毒素的检测方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫法、液相色谱-质谱联用法等，中国药典2010年版第二增补本采用高效液相色谱柱后衍生法测定。本文就中国药典黄曲霉毒素检验过程中常遇到的问题以及无衍生快速检测黄曲霉毒素的方法进行初步探讨。
　　2.2 超高效液相色谱和荧光检测器无衍生法快速检测黄曲霉毒素
　　2.2.1 线性关系、检测限和定量限精密吸取黄曲霉毒素混合标准品溶液( 黄曲霉毒素B1浓度为102.1 ng /mL) ，分别加50%甲醇制成浓度为每毫升含AFB10.204 2、0.408 4、2.042 0、6.126 0、20.420 0ng 的标准品溶液，摇匀，即得。分别精密吸取对照品溶液2 L，注入色谱仪中，记录峰面积，以浓度( ng /mL) 为横坐标，积分值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。结果表明4 种黄曲霉毒素线性关系良好。按进样浓度分别为信噪比的3  1 和10  1 计算检测限和定量限。
　　2.2.2 仪器精密度试验取黄曲霉毒素混合标准品溶液( B1浓度0.408 4 ng /mL) ，连续进样5 次，结果黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的RSD 分别为0.6%、1.2%、1.0%和0.2%，表明仪器精密度良好。
　　2.2.3 加样回收率试验取已知含量的桃仁( AFB20.26 g /kg，AFB11.69 g /kg) 样品5.0 g，精密称定，按低、中、高浓度分别加入2、5、10 mL 的黄曲霉毒混合对照品溶液( B1浓度2.042 ng /mL) ，按2.1项下方法制备供试品溶液，进样测定。
　　2.2.4 样品测定取所收集的柏子仁样品，按2.3项下方法制备供试品溶液，依法测定，通过标准曲线法计算供试品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量，结果与采用柱后碘衍生法测定结果相差不大。
　　3 讨论
　　采用0.01%碘溶液、衍生化泵流速0.4 mL /min与现行中国药典0.05%碘溶液、衍生化泵流速0.3mL /min 的衍生效果相差不大，但降低碘衍生溶液浓度，可以在实际检验过程中有效减少管路堵塞同时明显延长荧光检验器使用寿命。免疫亲和柱对黄曲霉毒素能特异性吸附，可以极大的减少其他杂质的污染，但中药材化学成分复杂，不同品牌的免疫亲和柱的回收率会有差异，因此在实际测定过程，需要根据实际情况选择合适的免疫亲和小柱。AFB1和AFB2在紫外光下可产生蓝绿色荧光，AFG1和AFG2在紫外光下可产生黄绿色荧光，反相洗脱液会淬灭黄曲霉毒素B1和G1的荧光效应，因此通常检测AFB1和AFG1的需要进行衍生。通常AFB1和AFG1的衍生方法主要有柱前三氟乙酸衍生法，柱后碘液法、电化学衍生溴法或光化学UV 衍生法，无论柱前衍生还是柱后碘( 溴) 衍生，均需配制衍生化试剂或增加额外的装置，同时还会造成系统的污染，而液相色谱-质谱联用法相对来说检验成本较高，适合用于阳性样品的确证。本文尝试用沃特世ACQUITY UPLC H-Class 系统，使用大体积的FLR 流通池，延长黄曲霉毒素在流通池的停留时间，从而使黄曲霉毒素检测信号增强，达到无衍生即可测定的目的，同时消除柱后衍生系统和降低带来的谱带展宽，形成尖峰，实现高信噪比，保证了定量更加准确; 另外，采用UPLC 代替HPLC，缩短了分析时间，减少了溶剂的消耗，使分析方法更加环保。致谢: 感谢沃特世科技( 上海) 有限公司曾玮在超高效液相色谱-荧光检测器无衍生快速检测黄曲霉毒素方法的建立上提供的帮助。