浅谈牙本质屏障细胞毒性试验的研究进展

　　评价口腔材料生物相容性的主要手段分为体外试验、动物试验和临床试验。尽管体外试验的临床相关性较其他两种方法略为不足，然而其具有简便、快捷且可以避免对动物和人体的伤害等优点，因此实际应用较为普遍。口腔材料的体外细胞毒性试验方法分为三类，即浸提液试验、直接接触试验和间接接触试验。牙体充填材料主要使用浸提液试验和间接接触试验。其中浸提液试验中的MTT法、XTT 法、中性红摄取法等试验可定量测定细胞毒性，间接接触试验中常用的琼脂扩散法和滤膜扩散法属于定性评价材料的细胞毒性。尽管上述方法已普遍用于口腔材料生物相容性的检测，然而许多研究表明，传统的体外试验中细胞的反应与体内试验中牙髓细胞的反应之间的相关性较低，此差异与牙本质的结构和牙髓细胞在体内的特殊生长环境有关。因牙体充填材料与人体的接触方式特殊，即在材料与牙髓细胞之间有牙本质的分隔，有学者于上世纪八十年代提出了一种专门适用于牙体充填材料的利用牙本质为屏障的体外细胞毒性试验，且发现其结果与临床实际情况有很好的相关性。经过不同学者长期的试验与研究，试验方法有很大改进，试验装置也发展为固定模型。目前应用的牙本质屏障法模拟了牙体充填材料充填入牙体后与牙本质接触的过程，材料及其可滤沥成分通过牙本质小管渗透到牙本质下方的细胞并与其接触，定量分析细胞的存活从而判定材料的细胞毒性[1]。与其他体外细胞毒性试验相比，此法更好地模拟了临床实际情况，具有替代动物试验( 如牙髓牙本质试验) 的可能性，更加适合用于评价牙体充填材料以及与牙本质直接接触材料的细胞毒性。此法在2008 年被国际化标准组织ISO列入牙科医疗器械生物相容性评价国际标准的资料性附录B 中，并已广泛应用于相关材料的毒性研究。由于在细胞培养、试验装置和牙本质的通透性方面仍有许多有待完善的部分，此法还不是常规使用的细胞毒性试验方法，目前国内也很少有学者使用该方法，本文就该方法主要关键技术点做一综述。
　　1 细胞的选择与培养方式
　　1. 1 细胞的选择
　　由于人牙髓细胞体外培养活性较低、稳定性较差，目前仍不能建立稳定的细胞系，因此在细胞毒性试验中，一般选择与人牙髓组织生理性质相类似的细胞来代替或使用已建标的稳定细胞系，如鼠成牙本质细胞系MDPC - 23[14 - 17]。ISO[3]中也推荐以下为适宜的细胞系: CCL 1 ( NCTC clone - 929) 、CCL163( Balb /3T3 clone A31) 、CCL 171( MRC - 5) 、V -79 379A、CCL 75 ( WI - 38) 、CCL 81 ( Vero) 和CCL10[BHK - 21( C - 13) ]。
　　虽然适宜的细胞系如成纤维细胞系广泛用于口腔材料的生物学评价试验，然而牙髓细胞与其他类型的细胞间存在较大差异，可表现为对材料的敏感程度不同。即便人口腔内的纤维细胞也与牙髓细胞有区别，Arenholt-Bindslev 等对人口腔颊黏膜成纤维细胞和人牙髓成纤维细胞进行了细胞学研究，发现它们在生长方式和酶活性方面均不相同，建议在进行牙科材料的毒理性研究时，应根据细胞的生物特性进行选择。因此，为更好模拟临床替代体内试验，牙本质屏障试验推荐使用牙髓细胞或生理性质相类似的细胞。
　　1. 2 细胞的培养方式
　　传统体外细胞毒性试验使用单层培养的细胞，但是其并不能很好地模拟细胞在人体中的真实生长状况。氧化锌丁香酚和玻璃离子水门汀在传统的细胞毒性试验和利用单层细胞培养的牙本质屏障试验中均表现出很强的细胞毒性，然而在体内使用中却并不损伤牙髓细胞。因此推断，不仅牙本质对材料的细胞毒性结果有影响，细胞的培养方式也是影响试验结果的原因之一。相比单层细胞培养，三维细胞培养可更好地模拟体内正常细胞的生长环境，细胞立体生长且紧密连接在一起，可建立细胞间和细胞与胞外基质间的联系，形成一定的三维结构，且动态的培养基也有助于模拟体内牙髓血液循环。Schmalz 等将三维细胞培养运用于牙本质屏障细胞毒性试验，利用在尼龙网上三维培养的人原代包皮成纤维细胞分别对多种水门汀进行了试验，氧化锌丁香酚和玻璃离子水门汀的毒性大大降低，取得了与体内试验一致的结果。原代细胞虽然比建立了稳定细胞系的细胞更接近体内细胞，但其不易获取，且稳定性差，经长期传代后蛋白质的表达易发生改变，因此可导致试验结果的重复性差。为了结合这两类细胞的优点，可利用病毒转染和3T6 方法来延长原代细胞的生长周期和维持其性质的稳定。Schmalz 等利用SV40 大T 抗原基因转染牛成牙本质细胞进行了一系列牙本质屏障细胞毒性试验，三维培养该细胞后的试验结果与体内试验以及用三维培养人原代成纤维细胞所进行的试验结果一致。因此，推荐使用三维培养的细胞代替单层细胞进行实验。
　　2 试验装置的设计与发展
　　2. 1 牙髓腔的模拟( 分隔小室)
　　此试验装置由最初的利用人牙冠自制密封牙髓小室，经不断地改进发展为目前普遍使用的细胞培养分隔小室装置，这使其可以更好地模拟牙体充填材料在口腔中的实际运用、更加易于操作、提高了试验结果的重复性且降低了不确定因素。
　　Hume最早利用蜡密封人磨牙牙冠髓腔部分从而形成一个密封小室，小室内充满新鲜的培养基。在牙冠的咬合面备洞且充填修复材料，修复材料所含成分可通过接触的牙本质渗透到小室内的培养基中。经过不同的接触时间，从小室移走培养基，利用单层培养的L929 细胞进行直接接触细胞毒性试验从而判定材料的细胞毒性。Hanks 等在此基础上改进了试验方法，用切割的牙本质片代替牙冠进行试验。将切割下来的牙本质片固定在自制体外牙髓小室设备的中间，从而将设备分割为上下两个部分以模拟窝洞和牙髓腔，上部填充修复材料使之与牙本质片的咬合面接触，下部充满细胞培养基，培养基的底部为单层培养的Balb /c 3T3 细胞。经过合适的接触时间后，对细胞进行毒性分析。在体外牙髓小室的基础上，Schmalz 等将市售的一种细胞培养分隔小室进行改装，将小室中间的薄膜用牛牙本质片取代使其适用于该试验，且运用较为广泛。目前的研究普遍使用自制的或经改装的细胞培养分隔小室，尚无市售的专门应用于该试验的装置。
　　2. 2 培养基的供给状态
　　由于细胞的培养方式由早期的平面培养，发展为三维培养细胞于网状支架上，培养基的提供方式也由静态改为动态灌流从而更好模拟人体实际环境。立体培养的细胞在细胞培养分隔小室中经动态灌流的培养基培养一段时间后与材料进行接触。与材料接触过程中，培养基可采取继续灌流或停止灌流两种方式。灌流与否对细胞毒性有一定的影响。与静态接触相比，以模拟人牙髓血液流动速度的2 mL /h 进行灌流接触，可降低材料的毒性，这也是目前广泛采用的接触模式。应避免灌流速度过大，如在5 mL /h 速度下液体的流动会带给细胞过强的机械作用力，可能导致细胞死亡，增加细胞的损伤。
　　3 牙本质片
　　3. 1 牙本质的通透性
　　牙本质的通透性是引起牙髓细胞毒性的直接因素，来自于材料的毒性物质通过牙本质小管及其内部液体的流动渗透到下方的牙髓细胞从而产生对细胞的毒性。牙本质的通透性越大，毒性物质通过牙本质小管渗透到牙髓的量越多，细胞毒性也就越大。由于近髓处尤其是中央区域的小管密度较高，直径较大，方向较均一，相对其他部位小管形态更加规律，因此为保证试验时所取牙本质片的通透性一致，可选取近髓处，牙本质小管尽可能垂直于牙本质片平面的部位，并使用牙本质片中间的区域。
　　由于牙本质通透性个体差异较大，即便选取了同一部位的试片也存在通透性不一致的可能。因此试验时对牙本质片的通透性进行评价和筛选，可提高牙本质屏障试验的重复性和准确性，为其提供依据。目前普遍采用的定量测量牙本质通透性的方法为液压通透装置配合毛细管系统，即在牙本质片牙髓面某一固定面积内施加一定高度的水柱压力，使液体从牙本质片牙髓面渗透到牙合面，液体的流量通过该装置所连接的毛细管中微小气泡的移动所获得。读数方式有两种，一种是通过肉眼读取气泡在微量管( 毛细管) 中的移动所对应的刻度，另一种是利用红外线探测移动距离。两种方法可以互换。
　　也有学者指出，利用牙本质片中间某一固定面积测量通透性只能对所选区域进行评价，而所选区域内小管分布、尺寸等会因不同个体、不同大小的牙齿而变化。另外，由于所选测量区域并不固定，因此重复测量时会因位置的变化而使通透性发生改变。这也提示了在用牙本质片测量通透性时，每次测量所选的区域应尽可能相同。
　　3. 2 影响牙本质通透性的因素
　　3. 2. 1 不同部位通透性差异由于牙本质小管具有从髓腔向外放射性分布的形态特点，不同部位的通透性差异较大。即便近髓处，不同部位的牙本质小管的密度也不同，相应的也会影响其通透性。有学者对人磨牙近髓牙合侧垂直于牙齿长轴和近髓颊侧平行于长轴的牙本质片进行了测量，发现牙合侧通透平均值大于颊侧。因此，应尽量使用同一部位的牙本质片进行实验。
　　3. 2. 2 其他因素通透性与牙本质片的厚度成反比，即牙本质片越厚，其通透性越低。有学者研究指出，厚度范围在0. 46   0. 50 mm 的近髓牙本质片的通透性与其厚度无显著相关]。国内外学者普遍采用( 500 50 ) m 的牙本质片进行研究，该厚度可模拟中等深度牙齿窝洞下方残留的牙本质厚度。也可根据临床实际选择不同厚度的牙本质片。通透性与测量过程中的水压大小成正比，与渗透液体的黏度成反比。因此测量时要选用统一的试验条件。
　　3. 3 人牙本质片的替代
　　人牙的个体差异较大且收集困难，牛牙牙本质在结构上与人牙相似，虽然在牙本质小管的尺寸和分布上有所不同，但其近釉牙骨质界处的牙本质小管的尺寸与人磨牙牙冠部位牙本质较为接近，可用来代替人牙本质进行研究。
　　目前有学者研究能否用其他材料代替牙本质来进行试验，Kim 等发现用聚亚安酯片或不同孔径组合的滤纸片模拟牙本质所测得的牙科粘接剂细胞毒性与用牛牙本质片的试验结果一致。这两类替代材料均为多孔，因此可产生与牙本质小管结构相似的通透性。然而Pashley指出牙本质作为屏障可起到降低物质浓度的作用，物质从小管向牙髓的扩散过程使其浓度降低，物质通过小管抵达牙髓时的浓度只是之前浓度的很小一部分，同时牙本质小管的特殊结构使其拥有很大的内部面积，因此具有吸附结合多种物质的能力，使他们在通过小管的过程中被吸附，特别是牙本质的主要成分羟基磷灰石对蛋白质有很强的结合能力。因此，是否可以用某种材料取代牙本质片，且适合各种材料的细胞毒性试验还有待进一步研究。
　　牙本质屏障细胞毒性试验能较好地模拟临床，在评价牙体充填材料细胞毒性方面有很大的价值，具有替代动物试验( 如牙髓牙本质试验) 的可能性。然而，在细胞的选择与培养、试验装置和牙本质片的选取等许多方面还有待进一步研究。