关于淋巴管内皮细胞的分离和鉴定

　　淋巴系统是由广泛的淋巴管网络组成，主要功能是收集组织间隙中的液体和蛋白质并将它们输入循环系统，同时也是白细胞和肿瘤细胞的进出口。淋巴管通过引导白细胞和抗原从组织到淋巴结在启动免疫反应中发挥重要作用。因此，淋巴系统在维持组织液平衡、参与肿瘤转移和调节免疫等功能中扮演重要角色。淋巴管内皮细胞衬覆于淋巴系统管道的管腔面，是构成淋巴管壁的主要结构。近年来，随着人们对淋巴管系统认识的不断深入，淋巴管内皮细胞逐渐成为研究热点。
　　淋巴管瘤是由淋巴管内皮细胞增生和扩张形成的一种良性肿瘤，好发于舌、唇、颊及颈部。淋巴管瘤通过压迫和浸润周围组织引起组织器官功能破坏，目前治疗以手术为主，但存在术后容易复发等问题。有学者采用局部注射博莱霉素，或者高渗盐水等，但可能引起周围组织的免疫反应或瘢痕回缩，导致原始病症扩大。因此，人们期待新的治疗方法，从而克服上述治疗方法的缺陷。迄今为止，淋巴管瘤病因仍不清楚。本研究体外分离培养淋巴管瘤相关淋巴管内皮细胞，为研究淋巴管新生在淋巴管瘤复发及肿瘤淋巴结转移中的作用提供体外细胞模型。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料 M199培养基、DMEM 培养基和胎牛血清均购于Gibco公司;胶原酶和collagen typeⅠ均购于sigma公司;鼠抗人FLT-4单克隆抗体购于Santa Cruz;兔抗人LYVE-1多克隆抗体购自RD公司;HRP-羊抗兔、HRP-羊抗鼠二抗均购于北京金桥公司;Cultrex BME 购于Trevigen公司;VEGF-C购于BD公司。舌淋巴管瘤标本来源于武汉大学附属口腔医院，本研究获得武汉大学附属口腔医院伦理委员会的批准。
　　1.2 淋巴管内皮细胞分离培养 舌淋巴管瘤标本分成两块，其中一块用4%多聚甲醛固定做蜡块，另一块置于冰M199培养基中(其中含10mg/L两性霉素、100u/mL青霉素、100mg/L链霉素和10%胎牛血清)用于分离细胞。组织取回后，在超净台内用Hanks液洗数次，用剪刀取出肿瘤周围的组织，将瘤块剪成约0.5mm0.5mm0.5mm 大小，用0.25%(w/v，胶原酶/无血清DMEDM)胶原酶在37 条件下消化45 60min;消化产物通过30mm孔径大小的过滤网过滤，过滤液1200r/min10min离心，然后用HankS液洗3次再次离心，用EGM 完全培养基重悬细胞，移至T25培养瓶，37 、5%CO2培养箱中培养。
　　1.3 免疫组织化学染色 石蜡切片常规脱蜡至水，切片置枸橼酸缓冲液(pH 6.0)中，用微波中高火加热5min，室温冷却，PBS缓冲液漂洗，5min加50L过氧化物酶阻断溶液，室温孵育15min，PBS缓冲液漂洗，5min吸干PBS缓冲液，加50L正常羊血清37  封闭10min后吸去不洗;加适当稀释度的一抗4 孵育过夜;PBS缓冲液漂洗，5min3次，加辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育30min;PBS缓冲液漂洗，5min3次，加新鲜配制DAB溶液染色，显微镜下观察出现阳性棕黄色着色时终止(5min);自来水冲洗，苏木素复染5min，1%盐酸酒精作用10s;自来水冲洗，1氨水浸泡30s;梯度酒精脱水(70%，80%，95%和100%各2min)，二甲苯透明5min，中性树胶封片。
　　1.4 电镜标本的制备 淋巴管内皮细胞接种后24h换液。72h用2.5%戊二醛磷酸缓冲液(pH 7.2)固定1h，然后用橡皮铲刮下贴壁生长的淋巴管内皮细胞，连同固定液移入离心管，离心(2000r/min)10min。沉淀物用1%锇酸固定，梯度乙醇脱水，树脂包埋，超薄切片，枸橼酸铅及醋酸铀染色，日立H-600透射电镜下观察。
　　1.5 细胞增殖实验 将淋巴管内皮细胞制成细胞悬液，进行细胞记数。1104 个细胞接种于96孔板，加入含10%胎牛血清DMEM 200L，在37 、5%CO2的培养箱中培养，1g/L MTT溶液加入每孔，培养4h，弃去MTT溶液，每孔加入DMSO(二甲基亚砜)中止，振荡15min，酶标仪测定560nm波长的A 值，绘制曲线。实验重复3次。
　　1.6 细胞体外成管试验 取200LⅠ型胶原(2g/L)加入24孔板中，37 作用30min，使胶凝固;每孔加入约1104 个淋巴管内皮细胞于胶表面。置37 、5%CO2培养箱中孵育培养7d，期间倒置显微镜观察并拍照记录，胶原胶固定于2.5%戊二醛，透射电镜观察形成管腔的超微结构。
　　2 结果
　　2.1 舌淋巴管瘤标本HE染色及免疫组织化学染色 HE染色结果显示舌淋巴管瘤组织中有大量扩张和增生的淋巴管，管腔中未见血细胞，而见少量淡染的液体，为管腔内残留的淋巴液。免疫组织化学染色结果显示，管腔中内皮细胞均高表达目前公认的淋巴管内皮细胞特异性标志物FLT-4、和LYVE-1，与文献报道一致。因此，可以认为淋巴管瘤为分离淋巴管内皮细胞提供了可靠的标本来源。
　　2.2 淋巴管内皮细胞的形态和超微结构 原代培养淋巴管内皮细胞生长较为缓慢，单层贴壁生长，显微镜下见细胞呈扁平的梭形或多边形，大小均匀，胞核呈卵圆形，有核的区域较无核的区域突出，培养14d左右生长至约90%融合。原代细胞生长至90%融合度时开始传代，淋巴管内皮细胞多在接种1h后开始贴壁，多个细胞组成的细胞团更易贴壁和分裂增殖，贴壁后的细胞呈梭形、三角形或多边形，形态与原代细胞相似，但生长速度较快，约7d融合，从传代第2天开始迅速增殖，至第6天开始生长缓慢，体现内皮细胞生长特有的接触抑制现象;当内皮细胞长满形成单层后，呈现典型的 铺路石 样外观，其中中央细胞较小而密集，周边细胞大而不规则，排列松散，其间可见少数几个梭形细胞。透射电子显微将观察淋巴管内皮细胞的超微结构，细胞呈鳞片状单层排列，镜下见大部分细胞呈团存在，可见细胞间的紧密或缝隙连接，可见内皮细胞特异性颗粒weibel-palade小体;可见到其它内皮细胞特征性细胞器如胞质小突和质膜小泡等。
　　2.3 淋巴管内皮细胞的体外增殖和成管实验 体外增殖实验显示淋巴管内皮细胞于第3天开始进入增殖活跃期，第5天进入高峰期，第6、7天进入平台期。体外成管实验显示淋巴管内皮细胞在Ⅰ型胶原培养基中可以形成管腔样的结构，并且随着培养时间的延长，从不同方向形成的管腔互相连接，形成类似于体内的复杂的三维淋巴管网络。透射电子显微镜观察管腔样结构的超微结构，可见由淋巴管内皮细胞围成的管腔，在这种细胞外基质成分存在的条件下，相邻细胞间的紧密或镶嵌重叠连接可见，模拟了体内淋巴管内皮细胞与细胞外基质相互作用的过程。
　　3 讨论
　　淋巴管瘤与淋巴管的扩张和异常增殖有关，Sironi M 等研究者在小鼠腹腔内注射弗氏不完全佐剂产生淋巴管瘤，然后再分离培养，得到鼠源性淋巴管内皮细胞，用于研究淋巴管内皮细胞的生物学特性，为研究淋巴管发生提供了细胞模型。本文中应用的舌淋巴管瘤标本，其病理特征与以往报道的淋巴管瘤病例一致。HE染色结果显示切片中有大量扩张的淋巴管，管腔中没有血细胞，而是有少量嗜伊红淡染的淋巴液;为进一步确定这些扩张管腔的性质，应用免疫组化染色检测淋巴管内皮细胞标志物的表达，结果显示管腔内皮细胞均表达FLT-4和LYVE-1，证实了其淋巴管的性质。因此，舌淋巴管瘤是淋巴管内皮细胞非常有价值的标本来源。
　　本文应用胶原酶消化法分离淋巴管内皮细胞，处理标本时应注意避免肿瘤周围舌组织细胞的污染，尽量去除周围组织，保证分离细胞的纯度;多次用含高浓度抗生素溶液洗涤去除组织表面的细菌和真菌。胶原酶作用时间的控制是能否得到高纯度目的细胞的关键，作用时间太短，得到的细胞较少，不易培养;时间太长，容易导致一些杂细胞的污染。在发现淋巴管内皮细胞特异性标志物之前，研究者大部分应用胶原酶消化法分离细胞。近年来，由于淋巴管内皮细胞标志物的发现，学者们开始应用免疫磁珠从各种不同组织中分离淋巴管内皮细胞。Simona Podgrabinska、Ernst Kriehuber和Taija Makinen等人分别应用标记有LYVE-1、Podoplanin和VEGFR-3抗体的磁珠从组织中分离相关亚型的淋巴管内皮细胞。事实上，这类方法分离得到的只是部分亚型的淋巴管内皮细胞，而且可能有其它细胞的污染如血管内皮细胞，不能较全面反映淋巴管内皮细胞的生物学特点;胶原酶消化法也有可能造成杂细胞的污染，如血管内皮细胞，间质细胞等等。为了得到较高纯度的淋巴管内皮细胞，本实验利用内皮细胞比较容易且呈团被消化的特性，使淋巴管内皮细胞与较难消化的污染细胞分开，传代时换新的培养瓶，弃去未被消化的细胞;同时，EGM培养基中添加能够选择性使淋巴管内皮细胞增殖的生长因子VEGF-C，有报道VEGF-C能够选择性使淋巴管内皮细胞增殖，而对血管内皮细胞没有作用;同时，有文献报道在内皮细胞培养基中加入适量的肝素能增强内皮细胞的生长能力，并能降低生长因子的用量，以便细胞长期培养，并保持细胞表型不变。因此本文在培养基中添加了肝素，在最大程度上获得高纯度淋巴管内皮细胞，并保留其在体内的分子表型和生物学特性以供研究。
　　在倒置显微镜下，淋巴管内皮细胞生长至80% 90%融合时，呈典型的内皮细胞形态学特征的 铺路石 样外观。传代培养后，收获细胞在透射电镜下观察超微结构，如以往文献报道，可以看到内皮细胞特征性颗粒weibel-palade小体;在超微切片中也可见到大量的胞质小突和质膜小泡等淋巴管内皮细胞特征性细胞器，也可见到细胞间的紧密和缝隙连接。细胞在Ⅰ型胶原培养基中形成复杂的管腔样网络，透射电镜观察证实淋巴管内皮细胞具有体外形成淋巴管样结构的能力，特征性细胞间的重叠连接，作为细胞间液中的液体和颗粒进出淋巴管的瓣膜，在电镜切片中均可见到。
　　本实验提示舌淋巴管瘤提供了宝贵的淋巴管内皮细胞标本来源，体外分离培养的淋巴管内皮细胞为研究淋巴管发生的分子调节机制提供了细胞模型，为治疗淋巴管瘤复发及肿瘤淋巴结转移奠定了基础。