当归贝母苦参丸含药血清对胃癌细胞SGC7901抑制作用机制的

　　当归贝母苦参丸出自《金匮要略》，原为治疗妊娠小便难，具有活血补血，化痰散结，清热解毒的功效。与肿瘤的发病正气不足，痰（湿）浊、热毒、瘀血内阻有着共同机制。近年来以用其加味治疗宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌取得明显疗效。其中绝大多数研究都是针对下焦癌变进行，而本研究拓展思路，将研究目光转向中焦胃癌。从基因转录水平和蛋白表达水平检测环氧化酶（cyclooxygenase，COX），Bcl2相关X蛋白（Bcl2associatedXprotein，Bax），抑癌基因（phosphataseandtensinhomologdeletedonchromosometen，PTEN），在细胞内的表达，探讨当归贝母苦参丸含药血清抑制胃癌细胞SGC7901的机制，为中医药经方抗肿瘤研究提供理论基础。
　　1材料
　　1。1动物及细胞
　　株SPF级Waster大鼠，合格证号SCXK（甘）20110001，体重（18020）g，雌雄各半，由甘肃中医学院科研中心动物实验室提供。饲养条件：室温2025，湿度4555。动物分笼饲养，食标准饲料，饮水自由，饲料由甘肃中医学院科研中心动物实验室提供。人胃癌SGC7901细胞株购于北京协和肿瘤研究所。
　　1。2药物及试剂
　　当归、贝母、苦参购自甘肃中医学院附属医院。DMEM培养基、胎牛血清（美国HyClone公司），四甲基偶氮唑蓝（上海华舜生物工程有限公司），二抗（中杉金桥生物技术有限公司），RNAisoTMPlus（批号D9810A），thePrimeSeriptRTreagent，kit（批号DRRO37A），SYBRPremixExTaqTM（批号DRR081A，英国TakarBio公司），国产分析纯试剂（北京化学试剂公司）。
　　1。3仪器
　　SWCJ1D型超净工作台（苏州苏洁净化设备有限公司），MCO18AIC型CO2培养箱（日本三洋公司），CKX41URFLT50型荧光倒置显微镜（日本Olympus公司），5804R型高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司），BioRadCFX96型荧光PCR仪（美国伯乐公司）。
　　2方法
　　2。1含药血清制备
　　2。1。1中药汤液制备将各复方中药药物饮片浸泡1h，煎煮2次，每次30min，纱布粗滤去渣，药液浓缩为含生药1，2，3gmL1。
　　2。1。2给药剂量方式及采血方法按完全随机化分组方法，将120只大鼠分为当归贝母苦参丸高、中、底剂量组和空白空白组，每组30只，中药组和空白组大鼠每天分别灌服中药和生理盐水0。01mLg1，2次d，均连续给药7d，正常饮食饮水。对每只大鼠于末次给药2h后，乙醚麻醉，腹主动脉采血，3000rmin1，15min离心分离血清，将各组已取备的30支血清混合，0。22m微孔滤膜过滤，56，30min灭活，80保存备用。
　　2。2细胞培养人
　　胃癌细胞株SGC7901接种于无菌培养瓶中，其中1组加入空白大鼠血清，其中1组加入10胎牛血清作为空白组，用于检验空白大鼠血清的特异性，其他3组加入不同浓度的含药血清；每组都加入含双抗的DMEM培养基，在37，5CO2，饱和湿度培养箱中培养。细胞单层贴壁培养，达到对数生长期时用0。25胰酶，37条件下消化，吹打成细胞悬液后接种传代。
　　2。3MTT法检测
　　细胞增殖取生长状态好，处于对数生长期的细胞，制备成密度为5104mL细胞悬液。96孔板每孔加入细胞悬液100L，细胞贴壁后，实验组加入不同浓度的含药血清与培养液，空白组加入等量的完全培养液，每个剂量设8个复孔。于24，48，72h后，各取一块96孔培养板，每孔加入浓度为5gL1的MTT20L。4h后弃去培养基，每孔加DMSO150L，摇床震荡10min，酶联仪于570nm处测出各孔吸光度A，按下式计算细胞抑制率。细胞抑制率（A空白组A给药组A空白组）100。
　　2。4RTqPCR检测
　　COX2，Bax，PTEN的mRNA表达水平总RNA提取：分别将空白血清和含药血清处理24h的SGC7901细胞用PBS清洗2次，加入预冷的Trizol1mL，冰上静置10min，使用细胞刮刮除细胞，转移至RNA酶处理过的1。5mLEP管中，加入0。2mL三氯甲烷，剧烈混匀，冰上静置5min；4，12000rmin1离心，15min；之后可见分层，小心吸取上清约0。5mL；加入0。5mL异丙醇，上下混匀，冰上静置10min；4，10500rmin1离心10min，可见核酸沉淀，弃上清，加入75乙醇溶解；4，8500rmin1离心5min，弃上清；干燥5min后加入适量DEPC水，存于80。提取RNA进行浓度纯度检测后，用TaKaRa逆转录试剂盒逆转录合成cDNA。使用CFX96RealTime荧光PCR仪扩增目的基因。COX2上游引物3GCCTGAATGTGCCATAAGACTG5，下游引物3AAACCCACAGTGCTTGACACA5Bax上游引物3GGATGCGTCCACCAAGAAG5，下游引物3GCAAAGTAGAAAAGGGCGACA5PTEN上游引物3GACTCTGGAATATCCCTGGACA5，下游引物3AGGTTTGCTGCATCGACATCTG5。采用荧光定量PCR试剂盒说明操作，使用CFX96RealTime荧光PCR仪扩增，条件为：9510s预变性，9510s，6020s40个循环分析溶解曲线，确认扩增产物的特异性，相对表达量计算采取2Ct法计算。
　　2。5免疫细胞化学技术检测
　　COX2，Bax，PTEN蛋白量的表达在24孔培养板中每孔置入无菌10mm10mm的盖玻片，将对数生长期的胃癌SGC7901细胞消化成单细胞悬液，接种于24孔培养板中，每孔500细胞贴壁后，空白组加入50L完全培养基，余孔加入空白血清、高、中、低含药血清各50L，每组设3个复孔。待细胞爬满盖玻片后，将爬片置于4多聚甲醛中过夜，PBS洗3次，5min次；滴加50L0。1TritonX100室温下孵育15min，PBS洗3次，5min次；滴加3H2O2室温下孵育30min，PBS洗3次，5min次；滴加50L5BSA封闭液，室温20min，甩去多余液体；滴加50L稀释过的RabbitAnticollagenType（1100），湿盒中4孵育过夜；以PBS代替一抗，作为阴性对照，PBS洗3次，2min次；滴加生物素化山羊抗兔IG，3720min，PBS洗3次，2min次；滴加试剂SABC，3720min，PBS洗4次，5min次；DAB显色，自来水冲洗1min；苏木素复染5min，0。5盐酸乙醇分化10s，氨水返蓝10s；梯度乙醇（70，75，80，85，95，100）脱水干燥，每一个梯度5min，二甲苯透明10s，甘油封片。倒置相差显微镜观察照相。每张爬片选择3个高倍视野，使用图像费你先软件对所拍照片进行分析，测定相对灰度值。
　　2。6统计学分析
　　采用SPSS19。0统计软件分析数据，计量资料以珋xs表示，多组间采用单因素方差分析，以P0。05为差异有统计学意义。
　　3结果
　　3。1对SGC7901细胞增殖抑制的影响
　　MTT法检测细胞活力，空白血清组与空白组相比较，差异不大，所以在下列比较过程中将把空白组作为基准组。发现10浓度的当归贝母苦参丸含药血清对人胃癌SGC7901细胞抑制作用最明显，与空白组比较，含药血清高、中、低组细胞的A明显降低，SGC7901细胞组72h的抑制率分别为：高剂量组达到35。21，中剂量组为32。39，低剂量组为21。12；差异有统计学意义（P0。05）。
　　3。2对SGC7901细胞
　　COX2，Bax，PTEN蛋白表达的影响COX2在空白组主要以强阳性和阳性表达为主，在含药血清干预组中，细胞着色逐渐变浅，COX2蛋白的阳性表达率由与空白组相比明显下降；促凋亡基因Bax在空白组中呈阴性或是弱阳性表达，在含药血清干预组中，细胞着色逐渐变深，呈阳性或强阳性表达，Bax蛋白的阳性表达率与空白组相比上升；抑癌基因PTEN蛋白着色逐渐变深，表达逐渐增强，呈强阳性或阳性表达，而空白组细胞着色较浅，呈弱阳性或阴性表达。
　　4讨论
　　胃癌是我国常见的肿瘤之一，其发病率和死亡率均居各类肿瘤的首位，因为早期胃癌无特异性的症状，所以大多数患者在就诊时就已到中晚期，而此时预后效果极差，常常因为术后复发或癌细胞侵袭转移而扩散到其他部位而死亡。肿瘤的发生发展是癌基因激活与抑癌基因受抑制的结果，并受相关基因的影响，其mRNA与蛋白的表达量亦影响癌细胞的发展与恶性肿瘤的预后。本研究从COX2，Bax，PTEN3个不同方向的相关基因探讨抑制肿瘤的机制，为寻找新的药物对其作用加以调控可能对胃癌治疗带来新的策略。
　　COX是前列腺素（PGs）合成的关键限速酶。COX2的表达与胃癌的浸润深度密切相关，研究表明表达COX2的细胞能够直接附着于基底膜，破坏基底膜的完整性，从而改变细胞的黏附性，促进肿瘤的浸润转移。Hp黏附于胃黏膜上皮，其释放的毒力因子直接与上皮细胞接触，而胃黏膜上皮损伤诱导COX2表达Hp感染可刺激诱导COX2的白细胞介素8（IL8），血管内皮生长因子（VEGF）等因子的释放。本实验研究表明，当归贝母苦参丸含药血清作用于胃癌细胞可以明显降低COX2的表达量，推测可通过抑制COX2的表达降低细胞间黏附的E钙黏蛋白活性，减弱肿瘤细胞的侵袭能力。Bax基因是Bcl2基因家族内的同源基因，Bax基因表达异常与多种肿瘤发生密切相关。Bax缺失在肿瘤的发生中起重要的作用，研究发现在多种肿瘤中存在Bax基因的低表达。Krajewski检测了119例乳腺癌，发现Bax缺失率为34，而正常的乳腺上皮细胞Bax阳性率为97。Bax表达与胃癌的关系研究不多，本研究结果显示当归贝母苦参丸含药血清使胃癌细胞中Bax表达阳性率为99。7，从而抑制Bcl2功能，加速细胞凋亡，抑制胃癌细胞的生长对胃癌发生、发展过程中可能起重要作用。PTEN是具有磷酸酶活性的抑癌基因，参与细胞生长调节，并在肿瘤细胞浸润、转移中起一定作用，恶性肿瘤的发生发展与PTEN缺失和突变有关，各类癌的总突变率为540。PTEN基因突变可以降低瘤组织中脂质磷酸酶活性，刺激肿瘤细胞生长并抑制凋亡。研究表明：PTEN蛋白的表达与淋巴结转移、侵袭程度密切相关。胃癌组织中PTEN基因的检测可了解与判断肿瘤增生，侵袭及转移的能力和程度。本实验研究表明，当归贝母苦参丸含药血清作用于胃癌细胞可以升高PTEN的表达量，从而抑制DNA的复制；PTEN升高，去磷酸化作用增强，从而抑制细胞周期，诱导细胞凋亡和分化，抑制其转移。
　　当归贝母苦参丸出自张仲景《金匮要略》。现代药理学研究证实，当归中多糖和阿魏酸可以抑制肿瘤增殖，是诱导肿瘤细胞凋亡或分化的天然诱导剂。贝母皂苷具有抗肿瘤作用。朱晓伟等研究表明：苦参碱和氧化苦参碱作用人胃癌SGC7901细胞后，可增加G0G1期细胞所占百分比，降低S期和G2M期细胞百分比。李伏娥等证实苦参碱对人胃癌（SGC7901）细胞具有明显抑制作用，诱导细胞凋亡并抑制端粒酶活性。本方中当归为君药，养血和血，行气活血，补虚扶正，增强机体攻癌毒的能力补虚扶正；贝母化痰散结，苦参清热利湿解毒，共为臣药；当归贝母苦参丸作为抗肿瘤的方剂，为古方新用，针对肿瘤的病因病机特点，全方药物切中肿瘤的病因病机，有活血补血，化痰散结，清热解毒祛湿之效，本实验研究结果显示当归贝母苦参丸通过对COX2，Bax，PTEN因子影响来抑制胃癌细胞的生长，但关于当归贝母苦参丸抑制胃癌细胞增殖的机制仍需进一步研究。