生髓育麟汤对实验性少弱精子大鼠附睾精子质量的影响

　　〔摘要〕目的观察生髓育麟汤对少、弱精子大鼠附睾精子质量的影响。方法60只大鼠按照常规饲养方法饲养，1周后随机抽出10只大鼠编入正常对照组，另外50只予雷公藤多苷片20mg（kgd）灌胃26d。造模完毕后随机抽取10只编入造模组处死，将剩下的40只大鼠随机分为4组：生髓育麟汤高剂量组〔20mL（kgd）〕、低剂量组〔10mL（kgd）〕、五子衍宗丸组以及不给予任何药物，只给予正常食物和水的观察对照组，每组各10只。实验结束后获取大鼠附睾精子对各组大鼠的精子质量进行分析。结果生髓育麟汤能明显增加精子密度、前向运动精子比例、精子活动率，并且随着浓度的增加，效果更显著，此外，生髓育麟汤还能改善精子运动特征参数；生髓育麟汤低剂量组、生髓育麟汤高剂量组与观察对照组比较，差异均有高度统计学意义（P0。01）。结论生髓育麟汤能改善少、弱精子大鼠附睾中的精子质量。
　　〔关键词〕生髓育麟汤；少、弱精子症；大鼠；动物实验
　　〔中图分类号〕R271。14〔文献标识码〕A〔文章编号〕16737210（2016）04（b）002205
　　〔Abstract〕ObjectiveTostudytheeffectofShengsuiYulinDecoctiononthespermqualityinratswitholigospermatism。MethodsSixtyratswerefedbynormolwayforaweek，thenfiftyratsoligospermatismmodelsbeenmadebyGTW。Tenratswerekilledasmodelsaftermolding，theother40ratswereequallypidedintofourgroups：thehighdoseShengsuiYulinDecoctiongroup〔20mL（kgd）〕，thelowdoseShengsuiYulinDecoctiongroup〔10mL（kgd）〕，WuZiYanZongTabletsgroupandtheobservationcontrolgrouponlyfeedbywaterandfood。Thespermfromtheratsepididymiswasextractedandspermqualityofeachgroupwasdetected。ResultsSpermdensity，proportionofprogressivesperm，spermatozoalmotivitywereincreasedbyShengsuiYulinDecoction，andthetherapeuticeffectwasincreasedwiththeincreasingoftheconcentrationofShengsuiYulinDecoction，andthespermmotionparameterswereimprovedbyShengsuiYulinDecoction；comparedwithobservationcontrolgroup，thoseindexesofthehighdoseShengsuiYulinDecoctiongroupandthelowdoseShengsuiYulinDecoctiongrouphadstatisticallysignificantdifference（P0。01）。ConclusionShengsuiYulinDecoctioncanimprovethespermqualityoftherattestiswitholigospermatism。
　　〔Keywords〕ShengsuiYulinDecoction；Oligospermatism；Rat；Zoopery
　　不育症是男性常见疾病，也是影响夫妻感情、家庭稳定的重要原因〔1〕。据世界卫生组织（WHO）调查表明：男性精子质量从20世纪中期开始呈下降趋势，目前已成为第三大疾病，仅次于心脑血管病和肿瘤〔2〕。早在1998年就有学者统计发现全球共有8000万对夫妇患不育症，并以每年200万对的速度递增，其中约50为男性因素〔3〕。男性不育症临床上常表现为少、弱精子症，病因众多，病机复杂，西医对此治疗手段有限，常常依赖人工辅助生殖技术。祖国医学治疗不育症的历史源远流长，有很多特点和优势。生髓育麟汤是深圳市中医院男科专门针对男性少、弱精子症而设定的方药，经过多年的临床观察证实该方有较好的疗效。为了进一步探讨其作用机制，分析其作用靶点，2015年10月2016年2月本研究采用生髓育麟汤对实验性少、弱精子大鼠进行研究，现将结果报道如下：
　　1对象与方法
　　1。1实验动物
　　本实验应用的SD大鼠购买于广州中山大学（大学城）实验动物中心（合格证号：SCXK（粤）20150029），雄性，体重为185200g。
　　1。2药物
　　雷公藤多苷片（glycosidesoftripterygiumwilfordii，GTW）由远大医药黄石飞云制药有限公司出品（国药准字Z42021212），五子衍宗丸由北京同仁堂股份有限公司出品（国药准字：Z11020188），生髓育麟汤药物组成：鹿茸、鱼鳔、龟甲胶、紫河车、人参、当归、熟地、山茱萸、山药、肉苁蓉、柏子仁、五味子、枸杞子、菟丝子、麦冬、桑椹子，由深圳和顺堂医药有限公司提供药材，深圳市中医院制剂室按照常规煎药方法制作，浓度为680mgmL。1。3模型制备
　　60只大鼠按照常规饲养方法饲养，1周后随机抽出10只编入正常对照组（G1组），继续日常饲养。另外50只给予GTW片20mL（kgd）灌胃26d。造模完毕后随机抽取10只编入造模组（G6组）处死，分析造模是否成功。剩下40只均分为4组：生髓育麟汤低剂量组（G2组）、生髓育麟汤高剂量组（G3组）、五子衍宗丸组（G4组）、观察对照组（G5组），每组各10只。
　　1。4用药方法
　　G2组及G3组分别给予10、20mL（kgd）生髓育麟汤灌胃26d，同时给予正常饮食。G4组大鼠采用五子衍宗丸1。2g（kgd），80mgmL灌胃26d，同时给予正常饮食。G5组造模后不给予任何药物，只给予正常食物和水。各组大鼠每周测量体重以调整给药剂量。实验期间保持良好的实验环境，食物、饮水、温度等各项基础条件均相同。
　　1。5检测指标
　　1。5。1安全性检测
　　处死大鼠后进行肾脏、肝脏组织活检，观察肝、肾病理变化情况。
　　1。5。2疗效性检测
　　1。5。2。1大鼠精液质量的常规检测采用北京伟力彩色精子质量分析系统（WLJY9000）检测。末次给药24h后处死大鼠，在37恒温条件下快速摘取并剪碎双侧附睾尾部，分别置于1mL37生理盐水中，并存放于37恒温箱中。30min后取悬液1滴置于精子记数板上，通过连接显微镜的摄像装置获取图像并分析、记录，检测精子密度、前向运动精子比例、活动率，进行量化分析。
　　1。5。2。2大鼠精液运动特征参数的检测通过计算机辅助精液分析系统（CASA）获得相关运动特征参数，包括精子直线运动速度、平均行程速度、曲线运动速度、头部平均摆动频率、头部摆动幅度、平均纵线性比值。
　　1。6脱落标准
　　实验过程中大鼠发生不明原因死亡列为脱落。
　　1。7统计学方法
　　采用SPSS13。0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数标准差（xs）表示，两组间比较采用t检验，多组计量资料比较采用方差分析；等级资料比较采用Ridit分析；以P0。05为差异有统计学意义。
　　2结果
　　2。1药物对大鼠体重的影响
　　实验后各组大鼠体重分别为G1组：（475。8024。04）g；G2组：（471。1011。03）g；G3组：（468。0013。21）g；G4组：（470。5025。18）g；G5组：（4710。521。05）g；G6组：（463。5021。07）g。各组体重有所增加，但6组体重进行方差分析，差异无统计学意义（P0。05），体重增加对研究无影响，具有可比性。
　　2。2安全性及不良反应检测
　　实验过程未见不良反应。大鼠的肝脏和肾脏制成病理切片送检，在高倍光镜下观察各组大鼠肝脏以及肾脏的病理变化。病理结果显示：观察对照组大鼠肝小叶内和门管区有不同程度的单核细胞、淋巴细胞浸润，肝细胞内水分增多、肿胀，胞浆呈空网状；肾小球无明显变化，肾小管腔内有透明管型。其他3组大鼠的肝脏和肾脏均未见到明显的损伤，与正常对照组比较，差异无统计学意义（P0。05）。
　　2。3实验后大鼠附睾精子的密度、前向运动精子比例、精子活动率的统计
　　G1组大鼠附睾精子质量最高，G6组精子密度、前向运动精子比例、精子活动率明显降低，G1组与G6组比较，差异均有高度统计学意义（P0。01）；G6组精子密度、前向运动精子比例、精子活动率与G5组比较，差异无统计学意义（P0。05）；实验后G2、G3和G4组精子密度、活动率和前向运动精子比例均有提高，且G3组更为显著，与G1、G2、G4、G5组比较，差异均有统计学意义（P0。05或P0。01）；G2组与G1、G4、G5组比较，差异均有统计学意义（P0。05或P0。01）。见表1。
　　2。4计算机辅助精液分析系统图像分析
　　G1组精子密度高，多为正常形态精子，运动轨迹以直线居多，单位时间内行程较长；G2组精子密度较高，可见少量畸形精子，精子运动轨迹较为杂乱；G3组精子密度较高，多数精子形态良好，单位时间内行程较长；G4组精子密度一般，可见较多畸形精子和圆形细胞，运动轨迹较为杂乱，单位时间内行程较短；G5组精子密度低，可见大量圆形细胞和碎片，运动轨迹紊乱，单位时间内行程较短；G6组精子密度低，畸形精子比例较高，运动轨迹紊乱，单位时间内行程短。见图1。
　　2。5实验后各组大鼠附睾CASA精子运动特征
　　G1组大鼠精子运动最佳，G6组的精子VSL、VAP、VCL、BCF、ALH、STR明显下降，与G1组比较差异均有高度统计学意义（P0。01）；实验后G5组参数无改善，与G6组比较，差异无统计学意义（P0。05）；实验后G2、G3组和G4组上述运动特征参数均有所提高，且G3组更为显著，与G1、G2、G4、G5组比较，差异均有统计学意义（P0。05或P0。01）；G2组与G1、G4、G5组上述参数比较差异均有统计学意义（P0。05或P0。01）。见表2。
　　3讨论
　　祖国医学博大精深，历代的众多医家都很重视男性不育症，在历史众多医学著作中我们可以找到关于男性不育的病名，如精少精冷天宦无子等，其中的生理特点、病因病机、辨证论治等方面都不乏记载。《黄帝内经》是古老的中医典籍，文中有关于男性的性与生殖系统的论述，阐明了人体形体与生殖功能盛衰的过程〔4〕，如《素问上古天真论》云：丈夫八岁，肾气实，发长齿更；二八，肾气盛，天癸至，精气溢泻，阴阳和，故能有子〔5〕又如文中还提到肾者主水，受五藏六府之精而藏之，今五藏皆衰，筋骨解堕，天癸尽矣。故发鬓白，身体重，步行不正，而无子耳。虽然肾气由盛至衰是自然规律，但养生得法能延缓衰老道者能却老而全形，身年虽寿，能生子也。文中认为肾气的盛衰，天癸的有无，脏腑功能是否协调，直接决定着男性的生殖能力，并且尚须夫妇阴阳和故能有子，这就为中医学关于治疗男性不育和养生保健奠定了理论基础〔6〕。明清时期中医理论继续发扬与创新，对男性不育症的病因、病机、诊断和治疗水平达到了一个全新的高度，涌现出大批有价值的文献著作，例如《石室秘录》和《傅青主男科》〔7〕。以傅山为代表的学派从脾、肾论治不育，认为脾为后天之本，肾为先天之本，先后天相互化生、相互促进。人体正常孕育功能需要脾肾关系的协调、五脏阴阳的调和，故治法当以温润填精、扶中健运君相并重、健脾益气〔8〕。精液清冷、质地稀少者，多因先天禀赋不足或者后天劳伤所致，对此类患者若只是片面温阳、滋阴则收效甚微，若不慎误用攻伐之品则后果更加不堪，应通过益精填髓之法，兼顾气血阴阳，广纳血肉有情之品，以求肾精充足，血气平正，这就为临床治疗少、弱精子症提供了理论依据。清代名医陈士铎是男科学方面颇有建树的一员，其著作《辨证录》中体现的学术思想与傅山一脉相承，生髓育麟丹〔9〕就是其中验方之一。该方由鹿茸、鱼鳔、龟甲胶、紫河车、人参、当归、熟地、山茱萸、山药、肉苁蓉、柏子仁、五味子、枸杞子、菟丝子、麦冬、桑椹子组成，具有益精填髓、生精种子之效。全方以滋补肾精为核心，所采用的鹿茸龟甲胶熟地等九味药皆入肾经，其中熟地黄滋阴补血，填精益髓，加上血肉有情之紫河车、龟甲胶、鹿角胶、鱼鳔共为君药；山茱萸、菟丝子、肉苁蓉、五味子为臣药，助君药补益肾精，并有收敛固精之效；俗话说养精须养血精血同源，故采用补血之当归，加上麦冬、桑椹子滋养胃阴共为佐药。方中加入人参、山药为臣，以求健脾培土，补益中气，防止食滞中焦妨碍脾土运化，有利于促进药物发挥效果。该方药性不温不燥，无金石、毒虫等峻烈之品，无伤胃之弊。陈氏言此方妙在纯用填精益髓之味，无金石之犯，可以久服无害，不但可以种子，兼可益寿延年〔10〕。广东省深圳市中医院长期应用此方治疗肾虚以及脾肾两虚型的男性不育症，深感此方之妙！本实验简化制作工艺，改丸剂为汤剂，专门针对少、弱精子症患者而设。根据我们前期的临床观察表明：生髓育麟汤有明显提高不育症患者精子数量、活动力，降低精子畸形率的作用〔11〕；前期实验研究显示：生髓育麟汤能改善不育症患者内分泌功能，提高血清睾酮水平，抑制生精细胞的凋亡〔12〕。
　　五子衍宗丸源自明代《医学入门》，是添精种子之方，旧称古今第一种子方。该方由枸杞子菟丝子五味子覆盆子车前子组成，经烘焙、晒干，上为细末，炼蜜为丸。经长期的临床验证具有补益肾精之功，为治疗男性不育症的经典药方。故本实验选择该中成药作为对照药。
　　精子在睾丸生精小管中产生，经过曲细精管、睾丸网和睾丸输出小管进入附睾，循附睾头体尾运行，逐步达到成熟并存储在于附睾〔13〕。附睾的头端和体端是精子成熟的部位，尾端是精子贮存部位〔14〕，所以实验动物精子一般是通过附睾尾部来获得，一来数量较多易获取，二来可以排除其他性腺的干扰，较客观反映睾丸、附睾物质代谢情况。任何损害睾丸曲细精管上皮结构及内分泌功能的因素都可以导致精子的生发障碍，也造成附睾内储存的精子数量减少，活力下降，例如环境因素、食品、药品因素等〔15〕。据多方面报道显示，GTW具有明显的生殖毒性，能够抑制睾丸的各级生精细胞，包括精母细胞、精子细胞和精子，甚至出现大量精原细胞脱落，阻塞曲细精管腔道造成少精子症〔16〕。大剂量使用GTW还对肝脏及肾脏造成一定的损害，并且所造成的病变随着时间推移不能自行修复〔17〕。精液分析是确定男性生育能力的重要手段〔18〕，但以往简单的显微镜下检测技术存在较大误差，并且不能测定精子微细运动特点，不符合现代男性不育症的诊断要求〔19〕。CASA则能较客观地评价上述指标，运动特征的描述更能反映精子受精能力、精子穿透能力〔20〕。所以本实验采用SD大鼠为研究对象，采用GTW造模，采取生髓育麟汤和五子衍宗丸灌胃，收集大鼠附睾尾部的精子，通过CASA观察实验药物对大鼠精子密度、前向运动精子比例和活动率，并收集比较精子运动特征各项参数，参照人类的标准全方位地评价实验药物的作用机制和靶点。
　　本研究显示：大鼠经造模后与正常对照组比较精子质量显著下降，精子密度和前向运动精子比例、活动率都较低，精子运动特征参数也下降，说明GTW损害了睾丸生精能力，造成大鼠附睾中的精子数量和质量都下降；造模组与观察对照组比较，其差异不明显，说明随着时间推移睾丸精子生发功能未见恢复，少、弱精子大鼠造模成功；生髓育麟汤高、低剂量组和五子衍宗丸组分别与观察对照组比较，其精子密度和前向运动精子比例、活动率均存在显著差异，运动特征参数也提升，说明两者可能减轻了GTW的损害，恢复了大鼠的生精上皮细胞部分功能，促使生精细胞的成熟和分化，以至于附睾内的精子数量和活动力有显著提升，精子的穿透能力和受精能力也增强，从而改善了大鼠的生殖能力。两者比较生髓育麟汤更胜一筹，且随着剂量增加效果更显著。从安全角度观察：生髓育麟汤组和五子衍宗丸组肝脏和肾脏均未见到明显的损伤，说明两组药物药性温和，应用于临床较为可靠。生髓育麟汤各组与正常对照组比较精子质量仍然较差，说明采用该方治疗后虽然改善了实验大鼠的精子质量，但还没有达到完全健康的水平。是否因为两个生精周期（26d）的治疗时间不够？继续用药或者加大剂量是否可以达到更好效果？中西药结合治疗是否可以提高疗效？也许未来可以通过优化药品制作工艺、增加实验观察时间进一步探讨。
　　综合各项研究结果可以证实：生髓育麟汤能改善实验性大鼠附睾中的精子密度、活动率和前向运动精子比例，优化了精子运动特征。本实验验证了生髓育麟汤的作用靶点在睾丸和附睾，作用机制是维护了睾丸和附睾内环境的稳定，促进生精细胞的分化和成熟。五子衍宗丸作为治疗不育症的传统药物其疗效已受肯定〔2122〕，而生髓育麟汤较五子衍宗丸更有优势，显示了推广生髓育麟汤治疗不育症的良好前景以及从脾肾论治不育症的科学性。生髓育麟汤是如何影响精子的生发功能？下一步也许可以从睾丸物质代谢、基因调控和蛋白表达干预方面进一步深入研究。
　　〔参考文献〕
　　〔1〕ErenpreissJ，SpanoM，ErenpreisaJ，etal。Spermchromatinstructureandmalefertility：biologicalandclinicalaspects〔J〕。AsianJAndrol，2006，8（1）：1129。
　　〔2〕江鱼。男子不育症诊断和治疗进展〔J〕。中国男科学杂志，2000，14（3）：5。
　　〔3〕KennethPR。YChromosomedelelioneandmalemfertility：stateoftheartchnicalimptications〔J〕。Androl，1998，19（3）：225。
　　〔4〕张若鹏，邵华。中国古代男性不育源流文献考〔J〕。中国文献杂志，2004，1（1）：1112。
　　〔5〕曹彦。中医治疗少精子症近况〔J〕。广西中医药，2003，26（3）：811。
　　〔6〕王明辉。中医性医学〔M〕。武汉：湖北科技出版社，1989：4。
　　〔7〕崔云。傅山男科学术思想探析〔J〕。光明中医，2008，23（10）：14281429。
　　〔8〕清傅山。傅青主男科〔M〕。北京：学苑出版社，2001：168。
　　〔9〕王绍印。《辨证录》男科学术思想探讨〔J〕。世界中医药，2011，6（2）：159160。
　　〔10〕陈士铎。辨证录〔M〕。太原：山西科学技术出版社，2011：85。
　　〔11〕古宇能，黄忠旺，陈德宁。经方生髓育麟汤治疗少精子症临床观察〔J〕。辽宁中医药大学学报，2010，3（11）：78。〔12〕古宇能，黄忠旺，陈德宁。生髓育麟汤对少精子症患者血清生殖激素和生精细胞调亡的研究〔J〕。辽宁中医药大学学报，2012，3（8）：125。
　　〔13〕熊承良，吴明章，刘继红，等。人类精子学〔M〕。武汉：湖北科学技术出版社，2002：44。
　　〔14〕陈伟，舒小林，陆祥。等。As203对大鼠生精细胞凋亡及其Bcl2Bax表达的变化〔J〕。中国中药杂志，2008，33（23）：28232826。
　　〔15〕郭应禄，胡礼泉。男科学〔M〕。北京：人民卫生出版社，2004：995996。
　　〔16〕WHO。WHOlaboratorymanualfortheexaminationofhumansemenandspermcervicalmucusinteration〔M〕。4th。London：CambridgeUniversityPress，1999：524。
　　〔17〕徐健，许增禄，钱晓青，等。Bcl2基因在小鼠睾丸及试验隐睾中表达的研究〔J〕。解剖学报，2001，32（1）：4750。
　　〔18〕世界卫生组织。不孕夫妇标准检查与诊断手册〔M〕。北京：科学出版社，1994：19。
　　〔19〕MiuraM，SasagawaI，SuzukiY，etal。Apoptosisandexpressionofapoptosisrelatedgenesinthemousetestisfollowingheatexposure〔J〕。FertilityandSterility，2002，77（4）：787793。
　　〔20〕程可佳，黎杰运，陈德宁。经方橘核丸对精子质量的影响〔J〕。中国临床实用医学杂志，2007，1（1）：22。
　　〔21〕安琪，邹练。五子衍宗丸治疗男性不育症的Meta分析〔J〕。中国性科学，2015，24（1）：8489。
　　〔22〕马文君，王传航。弱精子症的中医药治疗进展〔J〕。中国性科学，2014，23（10）：6669。