单味中药协同诱导小鼠CIK的初步讨论

　　细胞因子诱导的杀伤细胞( cytokine induced killercell，CIK) 作为一种高效的肿瘤杀伤细胞，在肿瘤过继免疫治疗中显示出良好效果，在人类CD+3CD+ 56的T 细胞是CIK 群体中主要效应细胞。小鼠CIK 细胞，表面高表达NK1. 1 和CD8分子。国内也有不少关于中药协同DC 或CIK 杀伤肿瘤的报道，但目前人们对其研究大多集中在临床应用。笔者对于将小鼠脾淋巴细胞诱导为CIK 进行了研究，成功用纯细胞因子诱导出了小鼠CIK 细胞，且明确了诱导方法。在此基础上，本研究以加入几种中药水煎剂同时细胞因子用量减少为原来的1 /2，探讨中药协同诱导小鼠CIK 的可行性。
　　1 材料与方法
　　1. 1 实验材料
　　实验动物为C57BL/6 小鼠，6   8 周，雄性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司( 合格证号: 11400700073629) ; 中药材虫草、石斛、黄精、仙茅、黄芪、人参、灵芝及半支莲购自北京同仁堂制药有限公司; 重组小鼠IL - 1、IL - 2、 - IFN 购自Peprotech 公司; 小鼠CD3单抗( 145 - 2C11) 、荧光标记单抗NK1. 1 - PE、CD3e - APC、CD8 - FITC 和DX5 - FITC 购eBioscience 公司; 小鼠淋巴细胞分离液( 达优) 购自达科为生物技术有限公司; 1640 培养基、胎牛血清、青链霉素购自GIBCO 公司; CCK - 8杀伤试剂盒购自东仁化学科技( 上海) 有限公司。
　　1. 2 小鼠外周淋巴细胞制备C57BL /6 小鼠行眼球摘除放血后拉颈处死，无菌条件下取脾脏，分离脾细胞，加入到小鼠淋巴细胞分离液中，密度梯度离心法获取小鼠淋巴细胞，无血清1640 培养基洗涤两次，用1640 调整细胞浓度为1 106 /ml。
　　1. 3 中药药液制备将1. 1 所列中药材剪碎放入煎药锅中，加入适量超纯水，中火力煎制，务使其保持微沸状态煎20 min，弃药渣，调节药液体积达1 g 生药对应10 ml 药液。分装后冻存于- 20  冰箱。
　　1. 4 确定最适用药浓度如1. 2 所述制备小鼠淋巴细胞，并铺入96 孔细胞培养板，放在37  、5%CO2孵箱中过夜孵育后，按浓度梯度( 浓度范围200   0. 032 g /ml) 在各孔中加入中药水剂，后经CCK - 8 检测，获得每种药剂最适使用浓度。
　　1. 5 小鼠淋巴细胞的诱导
　　1. 5. 1 纯细胞因子诱导1. 2 方法制备的小鼠淋巴细胞置培养瓶中，培养基为含10% 胎牛血清和1 500U/ml - IFN 的1 640，于37  、5% CO2培养，24h 后再向每孔培养基中均加入抗CD3单抗( 50 ng /ml) 、IL - 1 ( 200 U/ml) 、IL - 2 ( 300 U/m1) 。以后每3 天更换含相同浓度血清和IL - 2 的培养基。
　　1. 5. 2 单味中药协同诱导将1. 5. 1 方法中所用细胞因子的量减少至原来量的1 /2，同时加入相应最适浓度的中药水煎剂，其他培养条件及方法与1. 5. 1 相同，诱导效果由流式检测作为评价方法。
　　1. 6 诱导细胞的流式检测取培养2 周的细胞进行流式细胞检测。将细胞用0. 2% BSA 的PBS ( 流式检测Buffer) 洗涤两遍，再用该Buffer 重悬，调整细胞浓度为1 106 /ml。将4 种荧光标记抗体双染组合( NK1. 1 - PE + CD3e - APC、NK1. 1 - PE + CD8 -FITC、CD3e - APC + CD8 - FITC、NK1. 1 - PE +DX5 - FITC) 分别稀释于50 l 冰冷的流式Buffer 中，再分别向各管抗体中加入50 l 细胞悬液，混匀，置4  避光反应30 min; 用冷Buffer 洗涤两遍，每次1ml。最后用100 l 冷Buffer 重悬细胞，上流式细胞分析仪检测。阴性对照用未诱导的小鼠脾细胞。
　　1. 7 诱导细胞杀瘤活性
　　检测依据流式检测结果，将CIK 细胞特征性表面分子表达高的协同组分别与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0 混合培养，效靶比分别为: 50   1、25 1、10  1。用CCK - 8 试剂检测其对上述肿瘤细胞的杀瘤活性。杀伤活性计算公式为: 杀伤率% = 1 -( 实验A 值- 空白孔A 值) /( 对照孔A 值- 空白孔A值) %。
　　2 结果
　　2. 1 通过梯度稀释的中药水煎剂作用于小鼠淋巴细胞，后用CCK - 8 检测，得出各药促进细胞生长的最适浓度，用于接下来实验的使用浓度依据。
　　2. 2 不同中药水煎剂协同诱导的细胞经流式检测，与纯细胞因子诱导的相比，其中虫草、石斛、仙茅、黄芪4 种药剂可以在所诱导细胞表面表达与之相近量或更多的CIK 特征性分子( NK1. 1 + CD+8、CD+3CD8+、NK1. 1 - DX5 - ) 。
　　2. 3 虫草、石斛、仙茅、黄芪协同诱导的细胞和小鼠SP2 /0细胞按不同效靶比混合培养后，用CCK - 8试剂检测杀伤活性，结果显示石斛、仙茅和虫草组在效靶比较高时杀伤活性亦高，效靶比较低时杀伤活性差，黄芪组在中等效靶比时显示出杀伤效果，而高和低效靶比时无杀伤作用综上结果可以得出: 虫草、石斛、仙茅、黄芪4种中药水煎剂协同细胞组合诱小鼠脾细胞，所得到的细胞表面NK1. 1、CD3、CD8高表达，与纯细胞因子诱导得到的细胞相比，CD3、CD8双阳性率更高，且该4 种细胞对肿瘤细胞的杀伤作用明显，符合CIK 细胞的特征。因此，这4 种中药水煎剂可以协同细胞因子成功将小鼠脾淋巴细胞诱导为CIK 细胞。
　　3 讨论
　　很多中药在临床上有调节免疫的功能，实验也证明它们可直接作用于各类免疫细胞，如促进其活化和增殖、增强其功能等。因此二者结合，探讨中药是否可以在体外诱导和增强CIK 的作用是很有意义的。作为初步研究，本研究所选中药是在临床和实验中早已证明具有调节免疫及在抗肿瘤中常用到的单味药，并且使用的是中药的水煎剂。在这个基础上，可进一步探讨方剂及药物单一成分对CIK 诱导和功能发挥的作用。
　　本研究所选中药中，有4 种中药( 虫草、石斛、仙茅、黄芪) 的水煎剂可以在减少细胞因子用量的情况下，有效诱导小鼠淋巴细胞表达CIK 特征性表面分子。对其所诱导的CIK 进行杀伤小鼠肿瘤细胞实验，结果表明与纯细胞因子诱导的CIK 相比，石斛、仙茅和虫草组在效靶比较高时杀伤活性高，其中石斛和虫草组效果相对更好，仙茅效果较差。效靶比较低时中药各组杀伤活性差，黄芪组在中等效靶比时显示出杀伤效果，而高和低效靶比时无杀伤作用。这其中原因可能是: CIK 本质上是一群异质性细胞，不同中药参与诱导的细胞群成分有所差异。另外，本研究所诱导的CIK ( 包括纯因子诱导的) 与前期工作中用纯因子诱导的CIK 在表面分子表达百分比上也有所不同( 本次CD+3CD+8占优) ，可能原因为本研究诱导中 -IFN 和IL - 1 用量高于前期研究。
　　综上所述，本研究初步明确了利用中药在体外协同或促进CIK 的诱导是可行的研究方向。进一步深入研究建立用于筛选可诱导CIK 效应细胞或可增强CIK杀伤肿瘤效果的中药及有效成分的体外模型系统，对阐明其作用机制有着积极意义和前景。