浅谈纳米金生物共扼探针在酶活检测中的应用

　　1引言
　　自20世纪80年代以来，酶己发展成为一种重要的工业产品，在资源、能源短缺和环境不断恶化的今天，酶的研究己被提到空前重要的战略高度酶分析是研究酶活性的重要工具，酶分析方法根据其测定对象，通常可分为直接测定酶本身及测定酶催化反应产物两大类。酶分析方法的关键是对于特定酶或产物的高灵敏度和高选择性，即在其他物质存在的情况下不产生交叉反应或不干扰测试。
　　随着纳米技术的逐步成熟，纳米生物技术( nano-biotechnology)受到越来越多的关注。由此产生的纳米生物共扼化学(nano-bioconjugatechemistry)其巨大的应用前景使这门新兴学科以迅猛之势发展，己成为全球科研的最新热点。纳米生物共扼化合物是指通过物理或化学的偶合作用，将生物分子和纳米材料在其界面上联结而形成的复合物。其将纳米材料和生物分子的特异性功效互补，由非生物的无机纳米材料调控生物分子的功能，具有很高的附加值，其功效远远超过每一种单独的组分材料。生物分子(如核酸适配体，DNA等)的特异选择性，使纳米生物共扼化合物具有超高的选择性;同时纳米材料具有许多独特的性能，如:纳米尺寸依赖性(nanoscale size}lependent properties)、优良生物亲合性，以及大比表面积等使单个纳米粒子的表面可容纳多个生物分子紧密排列，实现高密度组装，可更有效地提高检测灵敏度。
　　因此用纳米生物共扼化合物组装的纳米生物酶探针，非常适合作为传统酶检测的替代物，可构建具有高灵敏度低干扰的创新型酶检测平台。瑞士伯尔尼大学的简路易斯雷蒙(Jean},ouis Reymond)是酶活检测领域的领军人物。他主编了第一本关于酶活检测的专著《酶检测》( Enzyme Assays )。在谈到纳米生物共扼酶活探针时，他预言:只要探针技术能够检测到真正可靠的底物，它将是未来酶活检测的最佳选择。
　　在酶活的检测过程中，纳米金、量子点、氧化钵等纳米材料广泛运用于酶活的检测。但是，在过去十多年里，纳米金或许是使用最广泛的金属纳米粒子。这是因为纳米金在可见光区域有较强的表面等离子体共振吸收谱带，可以引起溶液颜色强烈的变化。现在科学家可以制备尺寸均一、形貌可控的纳米金。这些不同尺寸的纳米金易于进一步功能化修饰，它们和各种小分子或者生物大分子通过静电引力、疏水或亲水作用力以及含有琉基的分子通过Au-S键形成纳米金生物共扼化合物。
　　基于纳米金生物共扼探针进行酶活检测，在灵敏度和特异性方面远超出常规的检测方法。借助纳米金优异的光学特性，可建立可视、简单、快速的酶活探针，满足酶筛选及生物工程中高通量酶活检测的需要，同时在酶活的基础研究和实际应用中提供非常有用的工具。
　　2基于纳米金的酶活检测方法
　　尽管纳米金有许多有趣的物理化学性质，但是绝大多数基于纳米金的酶活检测方法主要利用了纳米金以下两个特性:(1)纳米金表面等离子体共振效应(surface plasmon resonance effect);(2)纳米金碎灭荧光的能力。基于此，纳米金检测酶活主要采用的方法以比色法和荧光共振能量转移( fluorescence resonance energy transfer FRET)法为主。除了以上两种常使用的方法，还有其他一些方法，例如电化学方法、光散射法(light scattering)等。
　　2. 1比色法
　　纳米金生物传感器研究的一个重要方向是发展高灵敏度的比色检测方法，因为其不需要昂贵的实验仪器以及花费大量人力和时间。目前，比色法是基于纳米金检测酶活最常用的技术，纳米金的表面等离子体吸收峰随环境的变化十分灵敏，当纳米金由分散到聚集时将导致吸收峰红移，相反由聚集到分散时吸收峰蓝移，相应颜色的变化可以通过裸眼观测或用简单的紫外可见分光光度计进行定量检测。根据以上原理，对纳米金表面进行功能化修饰组装酶活探针有两种途径:一是从分散到聚集。功能化的纳米金初始状态为分散，颜色为红色;酶分子使纳米金表面修饰的酶底物被降解，从而使金纳米之间距离拉近，呈聚集状态，溶液呈紫色。根据溶液前后颜色的差异，利用紫外可见分光光度计即可定量检测酶活。
　　另一途径是从聚集到分散。通过酶分子对底物的催化切割，使初始聚集的纳米金呈现分散状态。根据纳米金聚集分散程度的不同，可以检测酶活的大小或者评价酶抑制剂的抑制能力强弱。借助纳米金颜色的变化，通过裸眼观测或借助简单廉价的仪器即可判断酶活性的大小，这给解决欠发达地区或者野外检测时因大型仪器不便携带的弊端带来了极大的好处。
　　2.1.1纳米金从聚集到分散途径
　　Scrimin课题组首先叩开了纳米金比色法在酶分析中应用的大门，他们设计了基于纳米金比色法的蛋白酶活检测传感方案:将作为蛋白酶底物的多肤链通过Au-S键修饰于纳米金颗粒表面，由于Au-S键的作用纳米金被相互连接，使其呈聚集状态，溶液呈紫色。但当蛋白酶存在时，连接纳米金的蛋白酶底物被催化切割断开，纳米金呈现分散状态，溶液颜色变为红色。Mirkin课题组报道了一种实时检测核酸内切酶活性及其抑制剂的方法，在纳米金表面分别修饰上带有琉基的单链DNA分子DNA1 ~ DNA2，且DNA1~DNA2互补。当二者混合时，DNAl~ DNA2链的互补作用使纳米金聚集呈紫色。核酸内切酶的存在可以在特有的识别位点破坏DNA1~DNA2形成的双螺旋结构，使纳米金被释放呈分散态。聚集到分散的程度与酶活的大小成正比，由此可以进行酶活定量检测;当该酶的抑制剂存在时，将抑制酶的活性，因此此方法也可以检测抑制剂抑制酶活能力的强弱。该方法不仅具有很高的灵敏度和选择性，还首次实现了高通量实时检测蛋白酶活性以及筛选酶抑制剂，是一种普适的蛋白酶活性检测方法。中科院长春应用化学研究所曲晓刚课题组设计了一种实时检测核酸内切酶活的方法。相对于Mirkin课题组所建立的核酸内切酶活性测定方法，该方法更简单，仅用一种单链DNA分子修饰纳米金，底物DNA分子(DNAsubstrate) 3粘性末端和探针DNA杂交，导致纳米金距离拉近，溶液变为紫色，当核酸内切酶存在的时候会特异性识别切割位点，从而使纳米金呈分散状态;当DNA甲基化以后，核酸内切酶则不能识别切割位点，此时溶液仍然为紫色，若DNA甲基酶和核酸内切酶都存在的时候，这时纳米金将由聚集变成分散状态，这种方法可以同时检测核酸内切酶和甲基转移酶的活性。
　　纳米金由聚集变为分散是比较困难的过程，在聚集状态下，酶必须钻入纳米金颗粒之间的网状结构中才能水解底物，无法充分的发挥酶活，因此，必须进行对照试验，方法繁琐，操作不太方便，实验误差也比较大。
　　2. 2基于荧光共振能量转移检测法
　　FRET是指供体和受体通过非辐射机制(没有光子的吸收或发射)发生的能量转移。FRET发生的主要条件是两个发色团之间的距离必须小于10 nm，因为供体和受体之间的能量转移会随着距离的增加产生巨大的衰减矿。另一个重要的条件是供体的发射光谱和受体的激发光谱之间要有重叠，重叠的程度越高，能量转移的效率越大。另外，两个发色团偶极距的相对取向也影响荧光共振能量的转移效率，当偶极子取向平行时荧光共振能量转移效率最高。
　　在基于FRET的酶活检测过程中，由于纳米金超高的消光系数以及宽的能带，它通常充当能量的受体(acceptor)，能有效碎灭供体(donar)所发射的荧光。采用FRET来检测酶活，通常的设计是用目标酶的底物将纳米金和能量供体直接连接起来，使二者的距离足够近，从而发生FRET。当目标酶存在时催化切割底物，使纳米金和供体之间linker断裂，距离变远，从而恢复荧光，是典型的信号signal on过程。课题组以多肤充当linker，将荧光染料连接在纳米笼(nanocage)的表面进行蛋白酶的活性检测。
　　实验结果表明，当蛋白酶存在时，多肤被水解切割，染料分子从纳米笼表面脱落，荧光得以恢复，从而可以检测蛋白酶的活性。通过改变纳米笼的尺寸可以调节其等离子共振(SPR)吸收峰，当纳米笼的SPR吸收峰远离荧光染料的发射峰时，所得实验结果的灵敏度将会大大提高。Ren等以纳米金作为能量受体，发光鲁米诺作为供体，利用共振能量转移法来检测。月台蛋白(AFP )癌症标记物，检出限低至2.5 ngmL-}，所建立的方法可以用于检测癌症病人血清中AFP的含量，所得结果与酶联免疫吸附测定(ELISA)结果一致，有望用到实际的医疗检测中。目前报道的FRET方法检测酶活都是荧光信号signal on过程，这可以显著提高分析检测的灵敏度[35 - 3A]，而、ignal off过程因为某些非特异性吸附造成干扰而使分析方法的灵敏度降低。
　　2. 3其他方法
　　酶活测定也可以通过散射光强度的变化，电化学信号的变化或者其他方法来进行。纳米金散射光强度的变化可以通过最为常用的暗场显微镜( dark}ield microscope)来进行观测。电化学方法主要包括循环伏安法(CV)、差分脉冲伏安法(DPV)、方波伏安法(SWV)以及计时库仑法(chronocoulometry)等。
　　电化学方法中，在电极表面固定纳米金能很大程度上提高电极的导电能力以及电活性物质的电子传递速率。正是基于这个概念，Willner课题组将事先修饰上2氰乙基演素腺A}吟的纳米金与葡萄糖氧化酶结合，然后通过双琉基将该复合物固定到金电极上组装了一个电化学传感器(如图6所示)。在这个体系中，纳米金与葡萄糖氧化酶的活性中心相连接，充当了电线( electron wires)的作用，使电极与活性中心的距离缩短，电子传递效率非常高，展现了很高的灵敏度。Astuti 和Mirkin 课题组也利用了该原理成功地检测了细胞色素c和目标DNA，尤其是后者建立的电化学传感系统有很高的灵敏度和选择性。
　　电致化学发光(ECL)由于在电化学过程中产生处于激发态的不稳定的中间体，当其释放能量回到基态时而发光。ECL不存在背景信号的干扰，通过控制所施加的电压可以控制反应速率，是一种高灵敏度和高选择性的方法。Li课题组通过ECL法检测了蛋白激酶A的活性，该传感器显示有较低的检出限(0.07 U/mL)和宽的线性范围(0. 07一32 U/mL)，以及很好的稳定性。与之相比，市售的免疫测定的检测限仅为5 U/mL。
　　3该传感领域易被忽视的酶
　　目前报道的基于纳米金生物共扼探针检测的主要还是一些常见的酶，例如激酶、碱性磷酸酶以及半肌天冬酶等，基于纳米金生物共扼探针检测的常见酶的种类以及酶所作用键的类型。
　　关于这些酶的底物特异性、酶的催化机理等性质目前己经被科学家们研究得较为透彻。还有很多酶(例如，脂肪酶、拓扑异构酶、连接酶等)在基于纳米金生物共扼探针的酶活检测中并没有相关文献报道，它们不仅是很多重要疾病的标记物，在实际生产中也有很重要的应用。例如脂肪酶，它是一种界面反应酶，底物为酷类化合物，水溶性较差，脂肪酶本身的溶解度也一般，底物水解发生在油刊又的界面上，属于异相催化反应。因此，其催化机理与其他酶差异很大。在脂肪酶活性检测时，通常需要添加乳化剂使底物更好地溶解和分散，但有些乳化剂(如吐温)本身就能被脂肪酶水解，所以这个过程给酶活的检测带来很大困扰。传统的测定方法，例如pH滴定法、平板法、浊度法等不仅操作繁琐且灵敏度和检出限都很差，如果在测定脂肪酶的活性过程中能够克服以上问题，不仅具有重要的理论意义，而且在实际应用中也具有重要的指导意义。我们课题组基于这样的原因，开展了纳米金共扼探针检测脂肪酶活性的相关研究，目前己经取得初步的实验成果，其他相关研究还在进行之中。
　　4结论
　　目前酶活的检测方法只停留在实验室阶段，很少实现商业化的应用(比如，诊断试剂盒)。另外，复杂样品中生物大分子非特异性的相互作用以及体内检测所带来的灵敏度很低等困难仍然限制着该领域的进一步发展。
　　比色法作为一个特殊的检测方法，依然是酶活检测领域的主要方法。目前，该领域仍然还有足够大的创新空间，这是因为纳米金仍然有许多特异性能还没被发掘并应用于酶活检测过程中，比如与形状相关的光学特性、基于颗粒大小的光学特性、等离子体能量共振转移以及催化活性等。随着对这些问题的逐步深入研究，未来有望取得一系列突破性的进展，并推动生物医学和生物纳米技术等学科的发展。