浅谈米曲霉3。042突变株高产酸性蛋白酶的发酵条件优化

　　酱油是以豆粕和麸皮为主要原料，利用曲霉等微生物发酵而成的一种调味品，富含蛋白质、多肽、氨基酸、糖分等。米曲霉（Aspergillusoryzae）作为酱油发酵的主要菌种，在酱油发酵过程中起到了决定作用，其酶系活性的高低将直接影响到原料的利用率和产品的产率，同时也影响酱油中可溶性含氮物的含量进而影响酱油的品质，因此对菌种的改良是酱油发酵行业永恒的工作。
　　目前我国大多数酱油生产厂家采用的米曲霉3。042，具有较高碱性和中性蛋白酶活力，酸性蛋白酶活力相对不足。为获得优良的菌株，国内对米曲霉3。042进行了反复的理化诱变和筛选，获得许多新型突变株，使得蛋白酶的活性得到了不同程度的提高。
　　常压室温等离子体（AtmosphericandRoomTemperaturePlasma，ARTP）诱变系统是一种新型的诱变技术，能够在大气压下产生温度在2540之间、具有高浓度活性粒子的等离子体射流，使微生物细胞壁和细胞膜的结构及通透性发生改变，并引起基因损伤，使得微生物基因序列和代谢网络发生变化，最终导致微生物产生突变。经诱变得到的突变株与出发菌株在形态方面会有变化，并与菌株生理性状以及生产能力方面有关，因此对菌株的形态研究在了解突变株性状方面有重要意义。
　　本研究以常压室温等离子体诱变米曲霉3。042得到的突变株B2为对象，研究了B2的微观形态、菌落形态以及酸性蛋白酶活力的变化，并优化了发酵培养条件，为突变株B2在酱油生产中的应用提供了实验依据。
　　1材料与方法
　　1。1菌种、材料与试剂
　　米曲霉（A。oryzae）3。042（CGMCCNo。3。00951）菌株：中国普通微生物菌株保藏管理中心；米曲霉突变株B2（CGMCCNo。8199）菌株：本实验室经ARTP诱变得到的高酸性蛋白酶活力菌株；豆粕、麸皮、黄豆粉：天津市天立独流老醋股份有限公司；酪蛋白、福林酚试剂：分析纯，北京索莱宝科技有限公司。
　　马铃薯葡萄糖培养基：称取200g去皮马铃薯，切成小块，加入1000mL蒸馏水煮沸30min，用双层纱布过滤得到清液，再加入20g葡萄糖，自然pH，固体培养基补加20g琼脂，121灭菌20min。
　　基础发酵培养基：豆粕20g，麸皮15g，加水20mL，121灭菌20min。
　　1。2主要仪器与设备
　　常压室温等离子体诱变系统（ARTP）：北京思清源生物科技有限公司；TU1810型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；光学显微镜：OLYMPUS公司。
　　1。3实验方法
　　1。3。1菌株形态观察（1）孢子悬液制备：取37培养3d活化的PDA试管斜面，吸取10mL无菌生理盐水加入试管中，震荡3min，吸取菌悬液至10mL灭菌离心管中，充分震荡2min，即得孢子悬液。稀释至1106孢子mL，常温保存备用。
　　（2）形态观察：微观形态采用载玻片培养观察法，菌落形态通过观察涂布孢子悬液的PDA培养基平板，并拍照记录。
　　1。3。2酸性蛋白酶活力测定称取发酵完成的成曲10g，加200mL0。05molL乳酸乳酸钠缓冲液（pH3。0）于500mL三角瓶中，37、180rmin摇床震荡1h，4000rmin室温离心10min，上清用乳酸乳酸钠缓冲液稀释10倍，即得粗酶液。采用福林酚法测定酸性蛋白酶活力，规定在40下每分钟水解酪蛋白产生1g酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位（U）。
　　2结果与讨论
　　2。1米曲霉3。042与突变株B2比较
　　2。1。1微观形态比较图1表明，与米曲霉3。042相比，突变株B2的菌丝与分生孢子的形态并没有显著的差异，米曲霉3。042的菌丝发达，但是分生孢子头较少，而突变株B2的菌丝短，分生孢子头较多。但是在培养过程中发现，米曲霉3。042的菌丝较长，产孢子较慢，而突变株B2的菌丝短，产孢子较快。
　　2。1。2最佳发酵时间的确定突变株B2与出发菌株3。042的酸性蛋白酶活性随发酵时间的变化如图11所示，发酵18h之后开始产酶。在48h时，突变株B2和出发菌株3。042的酸性蛋白酶活力均达到最大，但B2的酶活比3。042高出51。3。随着原料不断被米曲霉分解消耗，48h之后，酶活力出现下降，因此确定这2个菌株的最适宜产酶时间均为48h。
　　3结论
　　突变株B2与出发菌株3。042相比菌丝较短，分生孢子头多，产孢子较快。突变株B2的菌落在酪蛋白平板（pH3。0）培养5d呈现凸状隆起，而3。042则呈现类似脐突形的菌落；在固态发酵过程中B2的生长速率明显优于3。042；突变株B2的酸性蛋白酶活力比米曲霉3。042提高了39。9。对突变株B2的产酸性蛋白酶条件进行了单因素优化，得到的最佳培养条件为：麸皮70，豆粕30，加水量36；发酵温度30，发酵时间48h，接种量为1106孢子35g干曲。为今后推广突变株B2在酱油发酵中的应用提供了基础。