溶血率测定法在莪术油葡萄糖注射液安全性再评价中的应用

　　莪术油葡萄糖注射液为莪术油与葡萄糖制成的等渗注射液，收载于《中国药典》2005 年版二部，按化学类药物进行管理，质量标准中未进行溶血与凝聚的检查。莪术油是从姜科植物莪术的干燥根茎中提取的挥发油，含有呋喃二烯、莪术烯、吉马酮、莪术酮、莪术醇等多种倍半烯萜类成分，具有中药注射剂的特性，按《中国药典》2010 年版一部附录中药注射剂安全性检查法应用指导原则要求，应进行溶血性检查。莪术油具有一定的溶血性，并有可能增强聚山梨酯 80 的溶血作用，临床使用具有一定的风险。本文按《中国药典》2010 年版二部附录溶血与凝聚检查法和紫外分光光度测定溶血率法，对 3 家厂家生产的 22 批莪术油葡萄糖注射液进行溶血与凝聚检查和测定溶血率，考察莪术油葡萄糖注射液进行溶血检查的必要性，并为其安全性再评价提供参考。
　　1 材料
　　1.1 仪器
　　GNP9160 隔水式培养箱(上海精宏试验设备有限公司);TDL802B 低速离心机(上海安亭科技厂);TU1221 型紫外分光光度计(北京通用公司生产)。
　　1.2 试剂
　　莪术油葡萄糖注射液(厂家 A：批号 H12030505等 13 批，规格为 250 mL;厂家 B：批号 120339 等9 批，规格为 250 mL;厂家C：批号 2012041863，规格为 250 mL);氯化钠注射液(杭州民生药业有限公司，批号 31203276，规格为 250 mL:2.25 g)。
　　1.3 动物
　　新西兰种家兔，雌雄兼用，体质量 2.0 3.0 kg，余姚市泗门镇建飞实验兔养殖场提供，生产许可证号 SCXK(浙)2012-0050。饲养条件为温度 22 25  ，湿度 40% 70%。
　　2 方法与结果
　　2.1 溶血与凝聚检查
　　参照 2010 年版《中国药典》二部附录Ⅺ L 溶血与凝聚检查法。取洁净玻璃试管 5 只，1、2 号管为供试品管，3 号管为阴性对照管，4 号为阳性对照管，5 号管为供试品对照管。按表 1 依次在各试管中加入 2%兔血细胞混悬液、氯化钠注射液、纯化水、莪术油葡萄糖注射液溶液，混匀后，立即置(370.5) 的恒温箱中进行温育，3 h 后肉眼观察，如试管中上层溶液呈澄明红色，管底无细胞残留或有少量红细胞残留，表明有溶血发生。如红细胞全部下沉，上层溶液无色澄明，或上层溶液虽有色澄明，但与供试品对照管比较无显著差异，则表明无溶血发生。
　　2.2 紫外分光光度测定溶血率
　　2.2.1 10%红细胞混悬液的制备 取健康家兔心脏血液，放入含玻璃珠的锥形瓶中振摇 10 min，除去纤维蛋白原，使成脱纤血液，用 0.9%氯化钠注射液洗涤，2 500 r/min 离心 5 min，除去上清液，沉淀的红细胞再用 0.9%氯化钠注射液同法洗涤 3 次，至上清液不显红色为止。将所得的红细胞按其容积，用0.9%氯化钠注射液稀释成 10%的混悬液，备用。
　　2.2.2 供试品溶液的制备 用 0.9%氯化钠注射液按要求稀释至所需浓度。
　　2.2.3 取样品，用氯化钠注射液按 14、18、116、132 进行倍比稀释，取各稀释液 5 mL，同时以氯化钠注射液 5 mL 为阴性对照、纯化水 5mL 为阳性对照，分别加入 10%红细胞混悬液 0.2mL，在 37  放置 1 h 后，2 500 r/min 离心 5 min，取上清液在 545 nm 处测定吸光度(A)值，并分别计算各样品溶血率。
　　3 讨论
　　莪术油本身具有一定的溶血性，根据莪术油注射液使用说明书：高剂量的莪术油葡萄糖注射液具有一定的溶血性。在实验过程中，发现实验保温时间对试验结果有一定的影响，保温时间越长，溶血就越严重，因此在相同浓度下，保温 3 h 观察结果的溶血与凝聚阳性检出率要高于保温 1 h 后离心的溶血率测定结果。相对而言，保温 1 h 更接近临床使用方法。
　　从试验结果看，不同厂家间和同一厂家不同批号间莪术油葡萄糖注射液的溶血情况不同，为保证临床用药的安全性，有必要进行与溶血相关的安全性质量控制。
　　溶血与凝聚试验作为安全性检查项目，所采用的方法均为体外试管法(肉眼观察法)，即通过药物与红细胞直接接触，用肉眼来观察判断溶血情况。但本法结果受主观影响，且不能具体测出溶血红细胞的数量，容易引起纠纷。用分光光度法测定样品溶血率代替肉眼观察，消除结果判断的主观影响，能有效的规避这些问题。已经有相关的文献报道了溶血率测定法应用于中药注射剂的安全性研究。
　　莪术油葡萄糖注射液是一种中药注射剂，其作为小儿病毒性肺炎用药，50%以上均为小儿患者，其不良反应也时有报道。部分不良反应现象与溶血有一定的相关性，是否与样品溶血率有关，还待进一步证实。但莪术油葡萄糖注射液成分复杂，除了主药成分，还含有辅料，对辅料的品种和含量没有统一要求，因此控制莪术油葡萄糖注射液的安全性显得尤为重要。