浅析仙鱼汤对小鼠Lewis肺癌的作用

　　毕业论文
　　关键词：仙鱼汤药理学肺肿瘤中药疗法细胞凋亡基因表达调控细胞培养
　　1材料与方法1。2瘤株小鼠Lewis肺癌细胞株由中国医科大学肿瘤研究所提供，广州中医药大学第1附属医院中医肿瘤研究所长期移植传代。1。4主要试剂与仪器碘化丙啶（PI）染液为晶美生物工程有限公司产品；bcl2兔多克隆抗体、即用型过氧化物酶免疫组织化学染色（SABC）试剂盒（SA1022）均为博士德生物工程有限公司产品；RPMI1640培养基为Gibco公司产品；2甲苯、乙醇，均为市售分析纯；超净工作台（苏净集团安泰公司）；冷冻桌面离心机（Eppendorf5810RCentrifuge）；解剖显微镜（北京电子光学设备厂）；37电热恒温水浴箱（上海恒丰仪器仪表有限公司）；ALTRA型流式细胞仪（美国Beckmancoulter公司）；CS型烤片机（孝感市电子仪器厂）；亿鸣200病理图像分析系统（中国亿鸣）。1。6分组及给药接种24h后随机分为5组：仙鱼汤高剂量组（剂量为1。747gkg）、仙鱼汤中剂量组（剂量为0。874gkg）、仙鱼汤低剂量组（剂量为0。437gkg）、CTX阳性对照组（剂量为20mgkg）、荷瘤模型组。中药各组均予以0。4mL中药灌胃，CTX组予以0。2mL腹腔注射，荷瘤模型组予以0。4mL生理盐水灌胃，均每日1次，给药14d。
　　1。7观察指标及检测方法
　　1。7。1小鼠生活状态观察实验过程中观察小鼠的饮食、毛发、活动、精神状态等情况。1。7。3细胞周期分析及细胞凋亡检测取小块瘤组织，加入生理盐水洗净血迹后倒掉，再加入1mL生理盐水，用眼科剪剪碎组织，吸管轻轻吹打，过300目筛，收集单细胞悬液于流式专用管，加入2mL中性磷酸盐缓冲溶液（PBS），1300rmin离心5min洗涤2次，调整细胞计数约1106mL，加入体积分数70冰乙醇2mL吹打后封口固定，保存于4冰箱24h。将固定的单细胞悬液离心，去固定液，加入PBS重新悬浮，洗涤2次，300目筛网过滤1次，加入1mLPI染液（终浓度100mgL），4避光染色30min，流式细胞仪检测，收集50000个细胞，应用multicycle软件分析凋亡率5。1。7。5bcl2阳性表达检测采用免疫组化法。常规石蜡包埋后，4m厚连续切片，行SABC法免疫组织化学染色，用PBS液代替1抗做阴性对照。光学显微镜下观察，bcl2蛋白染色细胞浆呈棕黄色为阳性。在高倍镜视野（400）下随机计数5个视野。计算出各组的染色强度指数（stainingintensityindex，pSII）。pSII（pA强度瘤细胞0）（pB强度瘤细胞1）（pC强度瘤细胞2）（pD强度瘤细胞3）。其中A强度代表细胞浆wu特异性染色；B强度代表细胞浆呈特异性浅棕黄色，染色较浅；C强度代表细胞浆呈特异性棕黄色；D强度代表细胞浆呈特异性深棕色，染色较深。染色强度指数（pSII）的范围在036。
　　1。8统计学分析采用SPSS11。5统计软件处理。
　　2结果
　　2。11般状况的观察实验结束后，模型组、CTX组小鼠表现为身体瘦小，活动少，喜聚群，毛发缺少光泽；CTX组小鼠于实验57d开始出现脱毛，进食减少；仙鱼汤高、中、低剂量组小鼠脱毛现象少于CTX组及模型组，活动力优于CTX组及模型组。
　　2。2各组抑瘤率比较表1结果表明，仙鱼汤高、中、低剂量组及CTX组瘤体质量均低于模型组（。或。）。各仙鱼汤组随着药物剂量的增大，瘤体质量逐渐减轻，抑瘤率逐渐增高。表1各组Lewis肺癌小鼠的瘤体质量及抑瘤率比较（略）
　　Table1Comparisonoftumormassweightandtumorinhibitoryrateindifferentgroups
　　统计方法：单因素方差分析；。，。，与模型组比较2。4光镜观察模型组癌细胞大小和形态很不1致，可见瘤巨细胞；癌细胞核体积增大，细胞核和细胞浆比例增大，核的大小、形状、染色不1，可见巨核、多核，核染色深，核染色质呈粗颗粒状，分布不均匀；核仁肥大，数目增多，核分裂相增多，可见不对称性、多极性及顿挫性等病理性核分裂相，间质内淋巴细胞少见（图2a）。CTX组可见大片坏死，间质见较多的淋巴细胞等炎细胞浸润，纤维组织反应性增生（图2b）。仙鱼汤各剂量组可见癌巢内坏死面积增大，间质可见淋巴细胞等炎细胞浸润，可见较多的细胞凋亡小体（图2c、d、e）。
　　2。5各组bcl2染色强度指数凋亡相关基因bcl2的阳性产物主要位于细胞浆，可见大量的细胞浆棕黄色颗粒染色。仙鱼汤各剂量组bcl2的染色强度指数均显著低于模型组（。），并呈剂量依赖性，而CTX组与模型组比较差异wu显著性意义（。）。结果见表
　　3、图3。
　　表2各组小鼠Lewis肺癌组织的细胞凋亡率及细胞周期分析（略）
　　Table2Comparisonofcellapoptosisratioandcellcycleanalysisindifferentgroups
　　统计方法：单因素方差分析；。，。，与模型组比较
　　a。模型组b。CTX组c。仙鱼汤低剂量组d。仙鱼汤中剂量组e。仙鱼汤高剂量组
　　图1各组凋亡率检测流式细胞图谱比较（略）
　　Figure1Resultsofcellapoptosisratiodetectedbyflowcytometerindifferentgroups
　　a。模型组b。CTX组c。仙鱼汤低剂量组d。仙鱼汤中剂量组e。仙鱼汤高剂量组
　　图2各组肿瘤组织形态比较（HE染色，400）（略）
　　Figure2Morphologicalchangesoftumorcellsunderlightmicroscopeindifferentgroups（HEstaining，400）
　　a。模型组b。CTX组c。仙鱼汤低剂量组d。仙鱼汤中剂量组e。仙鱼汤高剂量组
　　图3各组bcl2阳性表达比较（免疫组化，400）（略）
　　Figure3Positiveexpressionofbcl2indifferentgroupsdetectedbyimmunohistochemicalmethod
　　表3各组bcl2染色强度指数比较（略）
　　Table3Comparisonofstainingintensityindexofbcl2indifferentgroups
　　统计方法：单因素方差分析；。，与模型组比较
　　3讨论
　　多数学者认为，肺癌发生发展的中医病机可以用痰、瘀、虚3个字高度概括。其中正虚是肺癌发生的基础，《医宗必读》云：积之成者，正气不足，而后邪气踞之。正虚又以脾虚为主，脾为生痰之源，肺为贮痰之器。正是脾虚导致痰浊内生，进1步血停成瘀，瘀血内生，痰瘀内阻，蕴积肺部，日久而发为本病。
　　广州中医药大学陈锐深教授从肺癌病因病机出发，以健脾清肺、化痰祛瘀为治疗大法，自拟了治疗肺癌的经验方仙鱼汤。方中君药为党参，具有补中益气、健脾益肺、生津养血的功效，为补益肺脾气之要药。黄芪配合党参，以补肺脾之气；浙贝母清热化痰、开郁散结；猫爪草散结消肿；3片化瘀散结止痛，共为臣药。仙鹤草收敛止血、解毒抗癌；鱼腥草清热解毒、消痈排脓；天冬养阴清肺生津；山海螺解毒消肿、排脓祛痰；山慈菇清热解毒、化痰消肿散结；守宫散结止痛，共为佐药。炙甘草调和诸药，为使药。综合全方，扶正祛邪，攻补兼施，使祛邪而不伤正，共奏健脾清肺、化痰祛瘀之功效。
　　【参考文献】
　　3马超英实验中医学基础M北京：中国协和医科大学出版社，2000：279。
　　4陈奇中药药效研究思路与方法M北京：人民卫生出版社，2005：1001。
　　5LiHuschtschaWA，BartuierCE，AndersonR，etal。CharacteristicsofcancercelldeathafterexposuretocytotoxicdrugsinvivoJ。BrJCancer，1996，73：54。
　　6同济医科大学病理教研室，中山医科大学病理教研室外科病理学M武汉：湖北科学技术出版社，1999：505。
　　7RomWN，HayJY，LeeTC，etal。MolecularandgeneticaspectsoflungcancerJ。AmJRespirCritCareMed，2000，161：1355。
　　8HishiiM，KurnickJT，RamirezMontagutT，etal。StudiesofthemechanismofcytolysisbytumorinfiltratinglymphocytesJ。ClinExpImmunol，1999，116
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