研非复制性腺病毒携带AT2

　　0引言
　　1975年Kohler和Milstein首先报道，用细胞杂交技术，使经绵羊红细胞（SRBC）免疫的小鼠的脾细胞，与小鼠的骨髓瘤细胞融合，并由此创建了第一个B细胞杂交瘤细胞株，获得了抗SRBC的单克隆抗体。他们首先创立了将能分泌特异性抗体的B淋巴细胞同无限繁殖的骨髓瘤细胞融合技术，为单克隆抗体的制备奠定了基础。这是免疫学，乃至医学史上的一个里程碑。本医学检验论文来源于专业代写医学论文的中国医学论文网，如有业务需求请咨询网站客服人员！
　　单克隆抗体以特异性高、性质均一和针对特定靶点定向制备等诸多优点而广泛应用于各种疾病的治疗，特别是在肿瘤领域内的应用备受关注。美国FDA先后批准了10多个用于治疗肿瘤的抗体药物，都是全长抗体。虽然单克隆抗体在肿瘤治疗中发挥了重要的作用，但全长单克隆抗体治疗肿瘤成本太高：治疗肿瘤的抗体需要量极多且纯度要求高，目前的生物制药工艺难以满足市场的需求，大规模、高密度的哺乳动物细胞培养技术是目前国际上的一大难题，这些均导致高生产成本及昂贵的价格，一般患者难以承受。
　　因此，本课题的目的是利用非增殖腺病毒作为载体携带全长抗体基因在体内表达全长抗体，这样可以避免在体外用哺乳动物细胞表达抗体，以及纯化等复杂而且昂贵的规程。AT2是一个对肿瘤有明显疗效的抗EGFR单克隆抗体Cetuximab。由于EGFR在很多肿瘤中都有过量表达，在肿瘤的发生、生长、抗药性和转移性中都起到了重要的作用。Cetuximab对过量表达EGFR的肿瘤有良好的治疗作用，现已被批准用于头颈癌、直肠癌和肺癌的治疗，无论是单独使用还是与其它药物联合应用都有很好的效果，只有很小的副作用，出现严重反应的概率不及万分之一。Cetuximab单抗应用其它肿瘤治疗的研究也在大力的开发中，在肿瘤的治疗中有很大应用前景，但是由于其生产成本过高，国内普通患者难以承担，而抗体基因治疗正好解决了这个问题。本研究根据人体内密码子的偏爱性选择修改了部分氨基酸密码子，构建了修改密码子后的重组腺病毒载体。体外实验表明，通过修改密码子后提高了抗体的表达量，通过Western和IFN实验检验，无论修改密码子与否，重组腺病毒在293细胞中表达的抗体与商品化的Cetuximab单抗相近的特性，分子量大小一致，与抗原EGFR有很好的结合，说明我们构建的载体表达的抗体是有活性的。
　　1。材料和方法1。2。1细胞培养A431细胞、SKBr3细胞和293细胞在5CO2，37条件下培养，培养液为含10FBS的DMEM。
　　腺病毒载体我们首先分别合成修改密码子前后的AT2抗体基因的轻链及重链，且在轻链及重链前面各自合成抗体的信号肽基因，用IRES元件连接抗体的轻链和重链基因，以实现AT2抗体的重链和轻链的平衡性及完整性，经PCR引入酶切位点后，逐步把重轻链基因装入载体pDC339中。
　　病毒滴度测定重组腺病毒载体Ad5AT2和Ad5NAT2经鉴定正确后进行大扩后，用HPLC法在纯化车间纯化，应用50组织培养感染剂量法（TCID
　　50）测定病毒滴度。
　　实验铺板293细胞，培养过夜后，按MOI10分别加入两个病毒，收上清用于抗体的检测实验。用双夹心ELISA法测定抗体的表达量；用Western鉴定其与商品化的Cetuximab单抗比较分子量大小；间接免疫荧光实验是根据抗原抗体反应的原理，用荧光标记抗体作为分子探针，检查抗体Cetuximab与A431细胞膜上的抗原EGFR结合的特异性，同时用EGFR阴性的SKBr3细胞做阴性对照。
　　2。结果
　　腺病毒穿梭载体pDC339AT2和pDC339NAT2的酶切和PCR鉴定结果。
　　用双夹心ELISA法测定病毒抗体的表达量：AdAT2与AdNAT2相比的表达量分别是：
　　25。2plusmn；5ngml和285。3plusmn；5ngml，通过修改密码子较大的提高了抗体的表达量。
　　3讨论
　　治疗各种疾病、顽症中有巨大的优势，但是由于其自身的某些性质，加上目前我们的生产抗体的技术和工艺，限制了抗体的应用。在当前的生产抗体的工艺比较复杂，需要综合多项技术，工艺和技术都被少数公司垄断，而且抗体的需要量也在增大，最后导致抗体的治疗成本极高。
　　为了降低成本和提高抗体治疗效果，基因治疗是一种新型有效的手段，我们可以通过把全长抗体基因装入载体，通过载体带进体内，是抗体在体内表达。这样既可以免去体外生产抗体众多复杂的过程，降低成本，又可以使抗体更好的在体内持续作用，更好的到达组织。
　　因此，如何找到一个安全的，有效的载体是关键。腺病毒成为一个重要的载体，由于我们对其研究得比较清楚，我们对其进行改造，删除负责病毒复制的E1A区以及其它多余的区域。
　　腺病毒作为载体应用于基因治疗中有众多优点，在目前的条件下，腺病毒载体相对于其它载体，更适合作为基因治疗的载体。
　　根据密码子的偏爱性，我们收集了高表达的氨基酸密码子，修改了部分抗体基因的密码子，以此来提高抗体的表达量。经Western鉴定和IFN实验证明腺病毒载体表达的抗体是完整和有活性的，特异性也很好，可以应用下一步的治疗研究。