抗原修复间接法不同修复时间的效果比较探讨

　　甲醛固定的标本，因抗原决定簇和醛的交联作用而使抗原被封闭，在进行抗体标记前，要通过修复的方法尽量把抗原暴露出来。抗原修复的直接法是指将修复液直接放入高压锅内对切片进行加热修复，而间接法是指把修复液先放入容器内再放入高压锅中，然后对容器里的切片进行加热修复。本文通过不同修复时间的间接法和直接法对比实验，探讨合适修复时间的间接法在免疫组化中的应用。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 标本 选取我院病理科2013 年6月12 月已证实抗原表达呈阳性的肿瘤标本15 例，标本经10%中性福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋切片，厚4m。
　　1.1.2 试剂 常用抗体 P63、CD56、SY、ER、PR、C-erbB-2、CK-pan、CD34、Bcl-2、CD45、TTF-1、CK5/6、P504S、CD117、CD2 共 15 种。柠檬酸抗原修复液（0.01 M，PH 6.0）、EDTA 抗原修复液（0.01 M，PH9.0）、PBS缓冲液（0.01 M，PH 7.4）、即用型快捷免疫组化MaxvisionTM试剂盒。以上试剂均购自福州迈新生物技术开发有限公司。
　　1.1.3 仪器 烤箱、电热高压锅、培养箱等。
　　1.2 方法
　　1.2.1 直接法 高压锅法：取一定量柠檬酸抗原修复液( 1500 ml )放入高压锅中，加热至沸腾，将置于耐高温塑料架上的切片放入，盖上锅盖扣上压力阀，继续加热2 min，打开排气阀，冷却至室温备用。煮沸法：取EDTA抗原修复液( 1500 mL )放入高压锅中，加热至沸腾，将切片放入，盖上锅盖（不拧紧不扣压力阀），继续加热20 min，冷却至室温备用。
　　1.2.2 间接法 高压锅法：取一定量( 250 mL)柠檬酸抗原修复液于耐高温塑料容器中，将容器放入盛水的高压锅中，加热至沸腾，将切片放入容器内，盖上锅盖扣上压力阀，继续加热，分别在2、3、5 min后，打开排气阀，测量容器内外温度，取出容器，冷却至室温备用。煮沸法：取EDTA抗原修复液( 250 ml )于耐高温塑料容器中，将容器放入盛水的高压锅中，加热至沸腾，将切片放入，盖上锅盖（不拧紧不扣压力阀），继续加热，分别在5、10、20、25、30 min后，测量容器内外温度，取出容器，冷却至室温备用。
　　1.2.3 免疫组化染色 检测步骤参照试剂盒操作说明进行，用PBS代替一抗作为阴性对照，每种抗体均用即用型抗体浓度进行实验。染色结果判断按阳性细胞百分数和染色强度计分：百分数为0计0 分， 25%计1分，26%~50%计2分，51%~75%计3分， 75%计4 分；染色强度无色计0 分，淡黄色计1 分，棕黄色计2 分，棕褐色计3 分。两种计分相加，0 分为阴性（-），2~3 分为阳性（+），4~5分为阳性（++），6~7分为阳性（+++），由2位病理医师采用双盲法进行评分。
　　2 结果
　　在高压锅间接法中，刚沸腾时容器内外温差相差较大（14  ），随着时间的增加，3min后，容器内外温度接近（95~96 ）；在煮沸间接法中，刚沸腾时容器内外温差相差14 ，时间增加至10min后，容器内外温度接近（95~96  ）。随着时间增加，染色效果逐渐增强，在高压锅间接法中加热5min后以及在煮沸间接法中加热30min后，修复所经历的单位时间温度（95  2min、95  20min）与直接法相当，染色效果接近。
　　3 讨论
　　目前，免疫组化已成为临床病理诊断必不可少的辅助手段，在鉴别诊断、预后评估和指导治疗等方面起着非常重要的作用。染色过程中抗原修复是关键步骤，它能把甲醛固定的标本封闭的抗原决定簇中的交联结构打破，使抗原蛋白分子链脱离其它束缚或联结，恢复抗原的原有空间形态，使抗原不同程度重新暴露出来，更好地与相应抗体反应，提高阳性表达率和表达强度，达到理想的标记效果，大多数标本都要经过这一处理，是决定染色成败的主要因素之一。抗原修复直接法的修复效果是肯定的，但对于小批量的染色修复液浪费过大。本实验发现，用相同的时间对同一抗原进行修复，间接法和直接法修复效果相差较大，但用不同的时间通过间接法对抗原进行修复，随着时间的增加，修复效果逐渐增强。当容器内外的温度接近时，再用直接法相同的时间继续加热，最终能达到与直接法相当的修复效果，说明选择合适的修复时间应用间接法对抗原进行修复是可行的，与齐文娟等报道一致。
　　在抗原修复间接法中，用柠檬酸抗原修复液进行高温高压修复时，加热到3 min，容器内外温度接近，故笔者认为加热时间选择为5 min修复效果较好，因修复所经历的单位时间温度（95  、2 min）及染色效果与直接法相当；用EDTA抗原修复液进行煮沸修复时，加热到10 min时，容器内外温度接近，故加热时间为30 min修复效果较好，修复所经历的单位时间温度（95  、20 min）及染色效果与直接法相当。本间接法虽然增加了总染色时间，但节省了修复液，还避免了锅体释放金属离子对修复的影响，对小批量的抗体标记染色比较实用，也适合在标本量少的基层医院推广。由于加热时间增加，脱片机率有所增加，除切片薄切外，玻片清洁彻底能克服这一缺点，用厂家经过系列处理的专用免疫组化染色玻片效果更好。容器外水位应低于容器3 cm左右，以免沸水溅入容器而改变修复液浓度和pH值从而影响修复。抗原修复的完整机制还没有完全弄清楚，有待于进一步研究。修复目前还未标准化，也没有一种抗原修复方法能适合各种抗体，抗原修复受标本固定液、蜡块保存时间长短、修复液种类、时间、温度、压力和pH值多种因素影响。在实际工作中应探索最佳的技术条件，不断提高免疫组化技术水平，客观地为病理诊断提供可靠依据。