Doxycycline抑制人肝癌细胞系HepG2生长的实验研

　　毕业论文作者：张强波李杰时昌文李捷孙京杰曹莉莉【关键词】肝肿瘤Doxycycline细胞凋亡FasLMMP2多西环素（Doxycycline）为4环素类抗生素的1种，已有研究表明其对前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等多种肿瘤生长有明显的抑制作用13，而其对人肝癌细胞的生长抑制作用国内外未见报道。本研究观察了Doxycycline对人肝癌细胞系HepG2的生长抑制和凋亡的影响，并初步探讨其作用机制。
　　1材料与方法1。2方法1。2。2TUNEL检测细胞凋亡取对数生长期生长良好的HepG2细胞，将其分别接种于200mL培养瓶中，细胞贴壁后更换成含终质量浓度分别为5mgL和20mgLDoxycycline的条件培养液作用
　　2hr4、48和72h。胰酶消化各组细胞后，取1滴细胞悬液于已消毒载玻片上，细胞贴壁生长4h制成细胞爬片，用11甲醇丙酮固定30min，保存备用。按TUNEL试剂说明书（Roche）操作，采用倒置荧光显微镜成像，随机选取5个视野300个细胞计算细胞凋亡率。1。3判断标准FasL、Fas及MMP2蛋白定位于细胞膜和（或）细胞质，阳性反应为细胞膜和（或）细胞质内着棕黄色颗粒。免疫组织化学结果判定参照文献4，以阳性细胞百分比及着色强度计分做半定量分析。随机观察5个高倍视野，根据阳性细胞数占细胞总数的百分比计为04分：无阳性细胞为0分，lt；25为1分，2650为2分，5175为3分，gt；75为4分；染色的深度以多数细胞的显色反应为准，着色强度计04分：无色为0分，淡黄色为1分，深黄色为2分，棕黄色为3分，棕褐色为4分。将上述两项指标的评分相加。每张片分别由2个观察者进行盲法测定，最后取两观察者所得平均值。
　　1。4统计学处理使用SPSS11。0统计软件，多组数据间的比较采用单因素方差分析或独立样本t检验，Plt；0。05为差异有统计学意义。
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　　2结果2。2Doxycycline对HepG2细胞凋亡的影响本研究选用
　　5、20mgL两个药物浓度观察其对HepG2细胞凋亡的影响，在24h后各组凋亡率差异无统计学意义（Pgt；0。05），而在作用
　　4hr8、72h后各实验组细胞凋亡率较对照组明显增加，Plt；0。01（表2，图2）。
　　2。3Doxycycline对HepG2细胞FasL、Fas及MMP2蛋白表达的影响本研究选用20mgLDoxycycline作用HepG2细胞观察对FasL、Fas及MMP23种蛋白表达的影响，作用48h后，FasL、Fas及MMP23种蛋白表达见表3。其中FasL蛋白表达积分较对照组明显增加（图
　　3），MMP2蛋白表达积分较对照组明显降低（图
　　4），而Fas蛋白表达与对照组相比差异无统计学意义，Pgt；0。05（图
　　5）。
　　3讨论细胞凋亡是1个比较复杂的过程，可通过多条启动途径实现，其中膜受体途径（FasFasL）是最重要的途径之1。LiuJ等7发现Doxycycline可通过FasFasL介导的膜受体途径诱导T淋巴细胞凋亡，最近研究报道Doxycycline能够明显抑制人胰腺癌细胞增殖，并证实其主要通过Caspase依赖的细胞凋亡发挥作用3。有报道表明人肝癌细胞系HepG2表面Fas有较强的表达8。本研究结果显示20mgLDoxycycline作用HepG2细胞48h后FasL蛋白表达明显增加，与对照组比较差异有统计学意义（Plt；0。05），而Fas蛋白表达差异无统计学意义（Pgt；0。05）。提示Doxycycline可能通过上调细胞表面FasL的表达而启动FasFasL介导的信号传导途径诱导细胞凋亡。药物对肿瘤的抑制作用机制往往是多方面、多途径的，同样Doxycycline通过何种途径影响细胞FasL及MMP2表达，其具体机制尚不完全清楚，有待做更进1步的实验研究和机制探讨。但初期的体外研究得到了较理想实验结果，有望为肝癌的临床诊治寻求1种新的药物治疗。
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