Doxycycline抑制人肝癌细胞系HepG2生长的实验研究

　　毕业论文 作者：张强波 李杰 时昌文 李捷 孙京杰 曹莉莉 【关键词】  肝肿瘤·Doxycycline·细胞凋亡·FasL·MMP-2      多西环素（Doxycycline）为4环素类抗生素的1种，已有研究表明其对前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等多种肿瘤生长有明显的抑制作用［1-3］，而其对人肝癌细胞的生长抑制作用国内外未见报道。本研究观察了Doxycycline对人肝癌细胞系HepG2的生长抑制和凋亡的影响，并初步探讨其作用机制。
　　1 材料与方法    1.2 方法    1.2.2 TUNEL检测细胞凋亡 取对数生长期生长良好的HepG2细胞，将其分别接种于200 mL培养瓶中，细胞贴壁后更换成含终质量浓度分别为5mg/L和20 mg/L Doxycycline的条件培养液作用
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　　4、48和72 h。胰酶消化各组细胞后，取1滴细胞悬液于已消毒载玻片上，细胞贴壁生长4 h制成细胞爬片，用1 1甲醇丙酮固定30 min,保存备用。按TUNEL试剂说明书（Roche）操作，采用倒置荧光显微镜成像，随机选取5个视野300个细胞计算细胞凋亡率。    1.3 判断标准 FasL、Fas及MMP-2蛋白定位于细胞膜和（或）细胞质，阳性反应为细胞膜和（或）细胞质内着棕黄色颗粒。免疫组织化学结果判定参照文献［4］，以阳性细胞百分比及着色强度计分做半定量分析。随机观察5个高倍视野，根据阳性细胞数占细胞总数的百分比计为0 4分：无阳性细胞为0分，<25％为1分，26％ 50％为2分，51％ 75％为3分，>75％为4分；染色的深度以多数细胞的显色反应为准，着色强度计0 4分：无色为0分，淡黄色为1分，深黄色为2分，棕黄色为3分，棕褐色为4分。将上述两项指标的评分相加。每张片分别由2个观察者进行盲法测定，最后取两观察者所得平均值。
　　1.4 统计学处理 使用SPSS11.0统计软件，多组数据间的比较采用单因素方差分析或独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
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　　2 结果    2.2 Doxycycline对HepG2细胞凋亡的影响 本研究选用
　　5、20 mg/L两个药物浓度观察其对HepG2细胞凋亡的影响,在24 h后各组凋亡率差异无统计学意义（P>0.05），而在作用
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　　8、72 h后各实验组细胞凋亡率较对照组明显增加，P<0.01（表2，图2）。
　　2.3 Doxycycline对HepG2细胞FasL、Fas及MMP-2蛋白表达的影响 本研究选用20 mg/L  Doxycycline作用HepG2细胞观察对FasL、Fas及MMP-23种蛋白表达的影响，作用48 h后，FasL、Fas及MMP-23种蛋白表达见表3。其中FasL蛋白表达积分较对照组明显增加(图
　　3)，MMP-2蛋白表达积分较对照组明显降低(图
　　4)，而Fas蛋白表达与对照组相比差异无统计学意义，P>0.05(图
　　5)。
　　3 讨论     细胞凋亡是1个比较复杂的过程，可通过多条启动途径实现，其中膜受体途径（Fas/FasL）是最重要的途径之1。Liu J等［7］发现Doxycycline可通过Fas/FasL介导的膜受体途径诱导T淋巴细胞凋亡，最近研究报道Doxycycline能够明显抑制人胰腺癌细胞增殖，并证实其主要通过Caspase依赖的细胞凋亡发挥作用［3］。有报道表明人肝癌细胞系HepG2表面Fas有较强的表达［8］。本研究结果显示20 mg/LDoxycycline作用HepG2细胞48 h后FasL蛋白表达明显增加，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），而Fas蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。提示Doxycycline可能通过上调细胞表面FasL的表达而启动Fas/FasL介导的信号传导途径诱导细胞凋亡。      药物对肿瘤的抑制作用机制往往是多方面、多途径的，同样Doxycycline通过何种途径影响细胞FasL及MMP-2表达，其具体机制尚不完全清楚，有待做更进1步的实验研究和机制探讨。但初期的体外研究得到了较理想实验结果，有望为肝癌的临床诊治寻求1种新的药物治疗。
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