甲氨蝶呤锌铝层状双氢氧化物的合成以及生物效应探究

　　1引言
　　水滑石类化合物包括水滑石（hydrotalcite）和类水滑石（hydrotalcitelikecompound，HTlc），因其主体一般由两种金属的氢氧化物构成，故又称为层状双金属氢氧化物（layereddoublehydroxides，LDHs）。LDHs的化学通式可表示为：〔M21xM3x（OH）2〕〔An〕xnmH2O，其中M2表示2价金属离子，M3表示3价金属离子，A表示层间阴离子，m为层间水分子的摩尔数〔1〕。LDHs的层间阴离子具有可交换性，因此，可将各种阴离子，如有机、无机、中性分子、酶及其他生物药物分子等组装到LDHs层间，进而得到具有不同性能的复合材料。此外，LDHs独特的层板结构能够有地保护插入其中的分子或离子。大量的研究证明，药物LDHs纳米复合物的合成不仅可以降低药物的毒副作用，提高药物的安全性、有效性，还可提高药物的溶解度和稳定性，控制药物释放速率。因此，近年来，将客体药物组装到LDHs层间制得药物LDHs纳米复合物的研究受到生物、医学和材料界的广泛关注。北京化工大学段雪等研究了多种生物药物插层LDHs层间的结构、性能以及药物释放的缓释性能等。山东大学侯万国等选用萘普生为模型药物分子，ZnAlLDHs为载体，合成了萘普生LDHs，又采用结构重组法制备了非离子型、水溶性差的抗癌药物喜树碱（CPT）LDHs。
　　甲氨蝶呤（MTX）是一类抗叶酸类抗肿瘤药，主要通过对二氢叶酸还原酶的抑制达到阻碍肿瘤细胞DNA的合成，从而遏制肿瘤细胞的生长与繁殖。MTX是治疗类风湿关节炎的主要药物，近年来也被用于治疗系统性红斑狼。但MTX具有体内半衰期短、组织分布广泛、不良反应严重及器官靶向性差等缺点。研究表明，MTX组装到LDHs层间形成MTXLDHs纳米复合物后，不仅能有效改善这些不足，而且能明显增强药物的稳定性，提高药效。目前，制备MTXLDHs的方法有共沉淀法、离子交换法、机械化学法、水热法、成核晶化法和焙烧还原法等。Choy等采用共沉淀法成功合成了MTXLDHs纳米复合材料，并分别将MTX和MTXLDHs作用于人类骨肉瘤细胞（SaOS2）。结果发现，MTXLDHs抑制肿瘤细胞生长的效率远远高于纯MTX，且体内释放半衰期延长、器官靶向性增强，同时证明了MTXLDHs在小剂量时仍具有很高的药效，其药效比纯MTX高5000多倍。
　　2实验部分
　　2。1试剂与仪器
　　硝酸锌（Zn（NO3）26H2O，A。R。，广东汕头市西陇化工厂有限公司），硝酸铝（Al（NO3）39H2O，A。R。，上海新宝精细化工厂），氢氧化钠（NaOH，A。R。，上海国药集团化学试剂有限公司），氨水（NH3H2O，A。R。，上海化学试剂有限公司），乙醇（C2H5OH，A。R。，上海国药集团化学试剂有限公司），磷酸二氢钾（KH2PO4，A。R。，上海凌峰化学试剂有限公司），甲氨蝶呤（MTX，A。R。，浙江省湖州展望药业有限公司），二甲亚砜（DMSO，A。R。，生工生物工程股份有限公司），小牛血清（BB001，生工生物工程股份有限公司），DMEM培养基（BC002，生工生物工程股份有限公司），MTT（T0793，生工生物工程股份有限公司），胰蛋白酶（PB068，生工生物工程股份有限公司）。实验用水均为去离子水。
　　2。2改进的共沉淀法合成MTXLDHs纳米复合物
　　称取0。8924gZn（NO3）29H2O和0。5627gAl（NO3）39H2O并溶于乙醇水（1：3，体积比）溶液中，配成混合盐溶液A；称取一定量的MTX（0。2045、0。2727、0。3408和0。4089g，使得Zn2Al3MTX摩尔比分别为R2：1：0。3、2：1：0。4、2：1：0。5和2：1：0。6）溶于8mL5的氨水中，配成溶液B；将B溶液转移至三颈烧瓶中，恒定60温度下磁力搅拌并通入N2，采用pH下降法以0。1mLs的速度滴加溶液A，用25的氨水调节混合溶液的pH为8。5，60下反应1h。最后，用去离子水和乙醇交替离心洗涤3次（离心速度为10000rmin，离心时间为1min）。合成的产物放至50mL的高压反应釜（内衬为聚四氟乙烯）中，经100、24h的水热处理后即制备出MTXLDHs纳米复合物。作为对比，采用同样方法，不加药物合成了ZnAlLDHs母体。
　　2。3缓释性能的研究
　　准确称取0。01gMTXLDHs溶解在50mLpH1。2的HCl溶液中，用移液管取容量瓶中5mL溶液置于50mL容量瓶中，加入45mLHCl定容，所得溶液浓度约为20gmL。用紫外可见分光光度计在306nm处测定其吸光度，并根据标准曲线计算MTX浓度，求出载药量。再根据载药量计算缓释实验所需要的MTXLDHs纳米复合物的量，称取后溶解于pH7。4（500mL）的磷酸盐缓冲溶液（按照中国药典2005年版第二部附录XIVE方法进行配制）中，在370。5下恒温搅拌。于预设定的时间间隔内，取3mL溶液高速离心分离，取上清液用紫外可见分光光度计在306nm处测量其吸光度，根据标准曲线计算出相应的MTX浓度和释放率，并绘制出MTX的累积释放曲线。
　　2。4采用MTT法初步研究MTXLDHs对肺癌A549细胞的增殖抑制作用
　　人肺癌细胞株A549购自上海细胞库，用含10小牛血清、100UmL青霉素和链霉素的DMEM培养基，于37、5CO2恒温培养箱内培养。将人肺癌A549细胞接种于100mL的培养瓶中，培养基为含有10小牛血清的DMEM，置于37、5CO2恒温培养箱内培养箱孵育，细胞为贴壁生长，用显微镜观测待细胞长满培养瓶的7080，用0。25的胰蛋白酶消化，传代。用10DMEM稀释细胞悬液，并接种到96孔板，每孔体积100L。正常培养24h后吸走废液，加入不同浓度的MTX和MTXLDHs（如20、40、60、80和120gmL），每组设6孔重复，对照组加100LDMEM（无血清）。分别培养24h后弃除96孔板中的残药和DMEM，每孔加入新鲜DMEM（无血清）90L和MTT10L（5mgmL，pH7。4的PBS配制），继续培养4h后，终止培养。
　　3结果与讨论
　　3。1FTIR分析
　　在不同R值条件下合成的MTXZnAlLDHs纳米复合物的红外光谱图，分子振动光谱常用于研究客体分子与主体层板、层间水等之间的作用力。从图中可看出，所有复合物红外峰的峰型与峰位非常相似，且与MTX红外峰位置基本相同。此外，母体NO3LDHs的红外光谱也标示于图中。可以看出，NO3LDHs的红外谱图与复合物有明显不同。对于母体LDHs，3430cm1处的峰对应LDHs层板上和层间水分子的OH伸缩振动，1637cm1处的峰对应层间水分子的变角振动，而1386cm1处的峰则对应NO3的吸收振动。对于MTXLDHs复合物，1386cm1处的吸收峰明显变弱，说明MTX已经取代了层间大部分的NO3，这说明，在反应中NO3与层板间强烈的静电作用使部分NO3不易除去。MTX的红外光谱中，1638和1508cm1处的峰分别对应COO的不对称及对称伸缩振动，当MTX插层到LDHs层间后，这两个峰分别红移至1614和1450cm1处。这是因为在碱性环境中，MTX末端的COOH电离为COO，带负电的MTX阴离子与带正电的LDHs发生强烈的静电作用使得COO的不对称和对称伸缩振动峰发生了红移。以上结果均表明，MTX组装到LDHs层间后，二者之间的相互作用使得MTX吸收峰位置和强度均发生了变化。
　　4结论
　　本文采用共沉淀法合成了不同的MTXZnAlLDHs纳米复合物，并考察了其缓释性能和癌细胞活性检测。研究结果表明，合成粒子的粒径会随R值的增大而减小。缓释实验结果表明，4种样品均具有明显的缓释性能，缓释曲线平稳。用modifiedFreundlich模型和parabolicdiffusion模型进行了分步动力学模拟，分析结果表明，MTXZnAlLDHs纳米复合物最初的释药过程属于表面药物的扩散，随后的释放属于粒内扩散占主导的多相扩散过程。生物细胞活性实验的研究表明，MTXLDHs较纯的MTX具有更好的抑制癌细胞增殖的作用，在一定范围内，其抑制作用随着粒径的减小而增强。