山药多糖对型糖尿病大鼠血糖血脂及肝肾氧化应激的反应

　　0 引言
　　山药( Rhizoma Dioscoreae) 是我国传统中药，别名怀山药、土薯、山薯、山芋等，其营养丰富，具有补脾养胃，生津益肺，补肾涩精等很重要的保健与药用价值. 山药的化学成分主要有山药粘液质、山药多糖、淀粉、氨基酸、脂肪酸、微量及常量元素、薯蓣皂苷、胆碱、多巴胺、山药碱、淀粉酶、多酚氧化酶、磷酸酶、维生素C 等. 现代药理研究表明，山药具有抗衰老、抗氧化、提高应激力、增强免疫力、降血脂、抗肿瘤、抗突变等功效，且主要活性成分是山药多糖( Rhizoma Dioscoreae polysaccharide，简称RDP) . 何云报道了在CCl4诱导的昆明小鼠急性肝损伤模型中，在给予山药多糖处理后，小鼠血清中丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶活性，肝、心肌、肾、脑和血清中的MDA 都显著降低. 此外，有文献报道山药多糖能剂量依耐性地降低四氧嘧啶诱导的Ⅰ型糖尿病大鼠的血糖水平.糖尿病是严重危害人类健康的代谢性疾病，因其发病机理不同主要分为Ⅰ型和Ⅱ型. Ⅰ型糖尿病也称为胰岛素依赖型糖尿病，多发生在儿童和青少年，多饮、多尿、多食及消瘦症状明显，血糖水平高，体内胰岛素绝对不足，容易发生酮症酸中毒，必须注射胰岛素治疗才能获得满意疗效，否则将危及生命. 其发病机制主要是自身免疫系统被破坏，即胰腺 细胞被破坏，导致机体胰岛素分泌下降或缺乏，此外还受遗传和环境因素的影响.目前国内外诱导糖尿病模型的药物主要有链脲佐菌素( STZ) 和四氧嘧啶. STZ 是一种氨基葡萄糖-亚硝基脲，对一定种属动物的胰岛 细胞有选择性破坏作用，能诱发许多动物产生糖尿病，一般采用大鼠和小鼠制造动物模型. STZ 通过葡萄糖转运蛋白2( GLUT2) 进入胰腺 细胞，一方面造成DNA 的甲基化和片段化，另一方面产生一系列的氧自由基，从而对 细胞产生毒性. Ⅰ型糖尿病与Ⅱ型糖尿病动物模型的制备与STZ 的给药方式有关，采用小剂量分次给药方法可建立与人类Ⅱ型糖尿病表现相似的大鼠糖尿病模型，采用较大剂量一次性注射的给药方法则可建立与人类Ⅰ型糖尿病表现相似的大鼠糖尿病模型. 本实验采用大剂量一次性注射的方法建立Ⅰ型糖尿病模型大鼠来研究山药多糖对糖尿病血糖血脂的影响.
　　1 材料与方法
　　1. 1 试剂
　　山药粗多糖由本实验室苗潇磊师兄提取制备，本实验对该粗多糖进行了如下处理: 1 000 g山药粗多糖浸膏于60  混悬于95%乙醇( 2 L) 4 h4 放置过夜取沉淀冷冻干燥实验用山药多糖RDP( 359 g) . 经测定，实验用RDP 中总多糖含量为41. 9%，蛋白含量为29. 7%，还原性单糖含量为31. 9%.检测大鼠空腹血糖( FBG) 、血清糖化血红蛋白( GHb) 、甘油三酯( TG) 、总胆固醇( TC) 、高密度脂蛋白胆固醇( HDL-C) 、低密度脂蛋白胆固醇( LDL-C) ，以及组织中丙二醛( MDA) 、超氧化物歧化酶( SOD) 、过氧化氢酶( CAT) 、谷胱甘肽过氧化物酶( GSH-Px) 、还原型谷胱甘肽( GSH) 的试剂盒均购自南京建成生物工程研究所( 江苏，中国) . 链脲佐菌素购自Sigma ( Saint Louis，MO，USA) . 强生稳豪型( ONETOUCHUltra) 血糖试纸购自Johnson( USA) .
　　1. 2 糖尿病大鼠造模及动物处理
　　45 只SPF 级雄性SD 大鼠( 180 200 g) 购于湖北省武汉疾病预防控制中心( 合格证号: SCXK( 鄂) 2008-0005，No. 4200695012) . 大鼠购回后适应喂养一周，此阶段平均每3 天清理鼠笼一次，之后随机分为造模组29 只和正常组18 只. 大鼠隔夜禁食12 h 后，造模组大鼠按40mg /kgbw 一次性腹腔注射STZ ( 用pH 4. 4 柠檬酸缓冲液配置浓度为1%的STZ 溶液) ，每天一次，连续两次，正常组大鼠则注射等体积的柠檬酸缓冲溶液，于注射7 d 后取尾静脉血，测造模组大鼠血糖值.随机血糖值16. 7 mmol /L，且伴有明显多饮、多尿、多食，且体重下降的大鼠，确定为糖尿病造模成功，血糖值 16. 7 mmol /L 的大鼠弃之. 整个实验期间所有的大鼠均分笼饲养，饲养温度保持在20 25  之间，相对湿度在40% 70%之间，自由取食、进水，昼夜交替时间为12 h /12 h.在确定造模成功血糖稳定后，将实验大鼠随机分为6 组: 正常对照组( normal control，NC) ; 正常给药低剂量组( NC-80，每日按照80 mg /kgbw 灌胃山药多糖溶液) ; 正常给药高剂量组( NC-240，每日按照240 mg /kgbw 灌胃山药多糖溶液) ; 糖尿病对照组( diabetic control，DC) ; 糖尿病给药低剂量组( DC-80，每日按照80 mg /kgbw 灌胃山药多糖溶液) ; 糖尿病给药高剂量组( DC-240，每日按照240 mg /kgbw灌胃山药多糖溶液) ，每组5 只大鼠，连续给药4 周. 山药多糖溶液用生理盐水配制，各组大鼠均自由饮水及进食.4 周后，动物禁食16 h，自由饮水，次日称重后用50%葡萄糖溶液按照2 g /kg 体重进行灌胃. 分别于葡萄糖灌胃后0，30，60，90 及120 min 尾尖针刺取血，用血糖仪测定血糖; 根据口服糖耐量试验( OGTT) 结果绘制血糖-时间曲线，实验结果用曲线下面积来表示. 次日大鼠禁食12 h，各组大鼠眼眶取血，部分抗凝测定糖化血红蛋白水平，部分于4 000 r /m 离心10 min 分离出血清测定血糖及血脂水平，然后颈椎脱臼处死，解剖后检测各主要器官发生病变情况，分离出肝脏、肾脏组织，剪取少量肝脏、肾脏保存于- 80  超低温冰箱中，用于组织中抗氧化酶及MDA 的测定.
　　1. 3 数据处理
　　结果以平均数 标准差表示，组间比较使用Student-Newman-Keuls 多重比较以计算显著性差异，当p 0. 05，则具有统计学意义; 当p 0. 01，则具有显著性差异.
　　2 实验结果
　　2. 1 山药粗多糖对Ⅰ型糖尿病大鼠血糖、血脂及GHb 的影响山药多糖对Ⅰ型糖尿病大鼠空腹血糖( FBG) 、血脂( TC、TG、LDL-C、HDL-C) 及GHb 的影响见表1. 与NC 组大鼠相比，DC 组大鼠体内出现糖脂代谢紊乱，其FBG、TC、TG、LDL-C 及GHb 均有显著升高( p 0. 01 或0. 05) ，HDL-C 无明显变化，表明大鼠造模成功. 与DC 组相比，DC 给药组FBG、TC、TG、LDL-C 及GHb 水平均剂量依赖性降低，HDL-C 水平剂量依赖性升高( p 0. 05) . 与NC 组相比，NC 高剂量给药组FBG 及TC 有一定程度降低作用，其他无明显变化.
　　2. 2 山药粗多糖对Ⅰ型糖尿病大鼠OGTT 的影响各实验组大鼠口服葡萄糖耐量实验结果见图1. 与NC 组相比，DC 组大鼠在空腹、30、60、90、120 min 血糖浓度都显著高于正常组，并且其曲线下面积( AUC0 120 min) 也显著高于正常组( p 0. 001) . 与DC 组相比，糖尿病大鼠在经过RDP 各剂量治疗后，血糖浓度升高现象均得到较明显改善，DC-80 组大鼠曲线下面积具有显著性降低( p 0. 05) . 实验结果表明，RDP 显著改善了由STZ 所诱导的糖尿病大鼠的糖耐量受损.
　　2. 3 山药粗多糖对Ⅰ型糖尿病大鼠肝脏抗氧化酶及MDA 的影响RDP 给药后对Ⅰ型糖尿病大鼠肝脏氧化应激的影响见表2. 与NC 组相比，DC 组大鼠的肝脏抗氧化酶水平显著下降( p 0. 05) ，脂质过氧化水平MDA 显著提高( p 0. 05) ，这与糖尿病大鼠体内产生高氧化应激相符. 与DC 组相比，糖尿病大鼠在给予RDP( 高剂量240 mg /kg. bw) 4 周后，其肝脏抗氧化酶( CAT、GSH-Px 和SOD) 活性及GSH 含量均有一定程度上升( p 0. 05) ，脂质过氧化MDA 水平显著降低( p 0. 01) . 此外，与NC 组相比，NC 大鼠仅高剂量给药后肝脏MDA 水平有一定程度降低( p 0. 05) ，其他指标均无变化.
　　3 讨论
　　糖尿病是一种最常见的人类代谢性疾病，其特点是胰岛素分泌缺陷和/或激活缺陷引起的高血糖.糖尿病血糖的降低是糖尿病治疗的主要目标，而糖化血红蛋白能很好地反映糖尿病状态下的平均血糖水平. 本实验发现，给予山药多糖后糖尿病大鼠的血糖和糖化血红蛋白水平均有明显下降趋势. 口服葡萄糖耐量试验反映了机体处理葡萄糖的能力，在糖尿病状态下，机体糖耐量能力受损，即糖耐量失常. 本实验发现，山药多糖能明显改善由STZ 诱导的Ⅰ型糖尿病大鼠的糖耐量.近几年来，越来越多的研究表明糖尿病表示出高氧化应激，并且氧化应激在糖尿病的发病机理及其并发症中起着非常重要的作用. 在氧化应激条件下，超氧阴离子自由基、羟基自由基和其他活性氧自由基的产生能够导致各种组织的破坏，可能会导致糖尿病及其并发症的发生. 内源性抗氧化酶，包括SOD、GSH、CAT、GSH-Px，负责清除体内过多的有害自由基，在保护细胞免受氧化损伤的过程中起重要作用。脂质过氧化是糖尿病患者的一个典型特征，脂质过氧化会反过来导致自由基水平升高. 脂质过氧化水平的提高会通过降低细胞膜的流动性和改变膜结合酶或受体的活性来损害细胞膜功能.
　　本实验发现，的抗氧化酶活性受到明显抑制，且肝、肾MDA 水平明显升高. 给予山药多糖后，肝、肾组织内的抗氧化酶有升高趋势，且MDA 水平明显降低，说明山药多糖对STZ 诱导的Ⅰ型糖尿病大鼠肝脏、肾脏氧化应激损伤有一定缓解作用.综上，灌胃山药多糖对STZ 诱导的Ⅰ型糖尿病大鼠高血糖、高血脂，及肝肾氧化应激损伤有一定程度的改善作用. 研究结果有助于深入了解山药多糖对糖尿病的治疗作用，对开发具有预防或治疗糖尿病功能的山药多糖产品具有一定参考价值.