谈补肾益肺消癥方干预肺纤维化大鼠TGF信号通路的作用机制

　　特发性肺纤维化( idiopathic pulmonary fibrosis，IPF) 是一种原因不明、以弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱最终导致肺间质纤维化为特征的疾病。特发性肺纤维化的病死率较高，确诊后平均生存时间为2  5 年，60%的患者直接死于该病，主要死亡原因包括特发性肺纤维化的急性恶化、急性冠脉综合征、充血性心力衰竭、肺癌、感染和静脉栓塞性疾病。目前，其病因不明且缺乏有效的治疗手段。基于中医学金水相生理论，我们制定了补肾益肺消癥的治疗法则，以经典方剂金水六君煎为基本方，创制补肾益肺消癥方。本课题组在临床补肾益气消癥方干预肺泡上皮细胞向成纤维细胞转化作用机制的研究中，运用补肾益肺消癥方治疗特发性肺纤维化数百例，系统整理30 余例，初步统计结果显示临床有效率达74. 5%，显效率34. 6%，对肺功能的改善亦有良好效果，时间肺活量FVC、肺活量VC、弥散功能DLco 等得到明显改善，患者激素使用量和频度均明显降低。为进一步研究补肾益肺消癥方治疗IPF 的作用机制，我们以博莱霉素致大鼠IPF 为动物模型，观察补肾益肺消癥方对IPF 大鼠转化生长因子( transforming growth factor TGF) -b 细胞信号传导通路中关键分子表达的影响，探讨该方疗效的作用机制。
　　1 材料与方法
　　1. 1 实验材料
　　1. 1. 1 动物及分组清洁级SD 雄性大鼠60只，体质量180 20g，饲养于东直门医院屏障级实验动物中心，随机分为空白组、阴性对照组、阳性对照组、中药小剂量组、中药中剂量组和中药大剂量组6 组。
　　1. 1. 2 药物及试剂造模用盐酸博莱霉素15mg /瓶购自日本化药株式会社; 补肾益肺消癥方( 当归、熟地、陈皮、法半夏、浙贝母、水蛭、炙甘草)均为免煎颗粒剂，由东直门医院药剂科提供; 醋酸地塞米松片( 天津天药药业股份有限公司) 0. 75mg /片，Rat TGF-b1 ELISA 检测试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司，SYBR green PCR master mix 购自美国ABI 生物公司，Rat-b-actin-antibody、Rat-Smad2 /3-antibody、Rat-Smad4-antibody 购自SantaCRUZ 生物公司，HRP 标记兔抗羊IgG 二抗购自武汉博士德生物科技公司。
　　1. 2 IPF 动物模型制作及药物干预
　　3. 5%水合氯醛麻醉大鼠，对照组和治疗组大鼠经气管插管，按5mg /kg 体质量缓慢注入博莱霉素，药物注入后立即将动物直立并连续旋转，使药物均匀分布于肺叶; 空白组经气管注入等量的生理盐水。动物造模结束后，第2 天开始药物干预。按成人剂量的5、10、20 倍，分别灌胃给予补肾益肺消癥方，阳性对照组按0. 05mg /kg /d 灌胃给予醋酸地塞米松片剂，空白组、阴性对照组分别给予等量的生理盐水，连续给药28d。
　　1. 3 动物取材
　　药物干预结束后腹主动脉取血分离血清，-20 冻存; 部分肺组织Trizol 一步法提取总RNA; 部分肺组织机械研磨，RIPA 组织裂解液提取总蛋白; 部分肺组织4% 多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋。
　　1. 4 ELISA 检测
　　取动物血清100ml，严格按试剂盒说明操作，稀释标准品，绘制标准曲线，450nm 处测OD 值，根据标准曲线计算血清中TGFb1 含量。
　　1. 5 Real-time PCR
　　总RNA 经反转录成cDNA，设计特异性引物，以GAPDH 为内对照设定相对标准曲线，根据Ct 值差异，real-time PCR 检测GAPDH 和TGFb1 受体( TGFb1Receptor TGFb1R) 基因的相对拷贝数，根据TGFb1R 拷贝数与GAPDH 拷贝数的比值，检测TGFb1R 基因表达量的差异。PCR 引物序列:GAPDH Forward 5-CCATGGAGAAGGCTGGG-3，Reverse 5-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3 TGFb1RForward 5- TGAGTGGCTGTCTTTTGACG -3，Reverse 5- TGGGACTGATCCCATTGATT-3 PCR引物由北京奥科生物有限公司合成。
　　1. 6 Western-blot
　　总蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后脱脂奶粉封闭; Rat-b-actin-antibody、Rat-Smad2 /3-antibody、Rat-Smad4-antibody 4 孵育过夜，二抗( 1  3000) 室温孵育2h，加入化学发光底物暗室显影。以b-actin为参照，根据条带灰度比分析Smad2 /3、Smad4 蛋白含量的差异。每组选取3 个不同的样本重复上述实验。
　　1. 7 HE 染色
　　切取0. 3mm 石蜡组织切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水，苏木素染色，流动水冲洗后伊红染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察肺组织病理改变并拍照分析。
　　1. 8 统计学方法
　　采用SPSS 13. 0 软件进行统计分析，结果以均数 标准差( 珋x s) 表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，2 组间均数比较采用LSD 法，P 0. 05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2. 1 各组大鼠血清中TGF-b1 含量比较
　　通过ELISA 检测各组大鼠血清中TGF-b1 含量。结果显示，补肾益肺消癥方可以明显降低IPF大鼠外周血血清中TGF-b1 含量，大剂量组效果尤为明显，与模型组比较差异有统计学意义( P 0. 01) ，中剂量组与模型组比较差异无统计学意义。中药大剂量组TGF-b1 含量较阳性对照组为低，效果优于阳性对照组。
　　2. 2 各组大鼠肺组织中TGF-b1R 基因表达的差异
　　Real-time PCR 实验结果显示，各组IPF 大鼠肺组织中TGF-b1R 基因表达量经统计学分析，差异无统计学意义。鼠肺组织中Smad 2 /3 含量较正常组有所下降; 与模型组比较，中药中剂量组和小剂量组降低较为明显，阳性对照组与模型组比较含量有所升高。阳性对照组和中药各治疗组与模型组比较，肺组织中Smad4含量均明显升高，以中药小剂量组升高最为明显。显示，HE 染色分析发现，模型组大鼠肺组织中肺泡结构破坏，成纤维细胞大量增生，纤维组织呈条索状瘢痕改变、斑块状分布。阳性治疗组和中药治疗组肺泡壁轻度增厚，肺泡结构破坏程度较轻，存在成纤维细胞增生; 中药大剂量组纤维化程度较模型组及阳性对照组明显改善。
　　3 讨论
　　在IPF 的发病和病情进展中，络脉痹阻、气血不荣于肺致肺脏萎缩是发生肺纤维化的病机所在，肺络癥瘕是肺间质性纤维化的重要病理机转。补肾益肺消癥方以经典方剂金水六君煎为基本方，加黄芪、水蛭、浙贝母等，诸药合用共奏补肺通络、化痰消癥之功，在临床化裁治疗肺纤维化取得较好疗效。IPF 早期或急性期病理改变主要为肺泡炎，急性炎症导致肺泡组织的损伤，启动自身免疫反应，导致血小板聚集、血块形成，血管随之舒张，通透性增强，使渗出物和粒细胞募集于损伤部位。在炎症损伤部位，趋化因子募集炎症细胞，在有细胞碎片的急性损伤部位和吞噬细胞清除坏死组织的区域有中性粒细胞、嗜酸性细胞、淋巴细胞和巨噬细胞聚集。在IPF 中，特殊炎症细胞对后续发生纤维变性的作用还不明确。许多细胞因子在不同条件下激活不同的基因表达，参与创伤修复和纤维变性的全过程。
　　TGF-b 在肺纤维变性进程中发挥着重要作用。TGF-b 存在显著的前纤维变性活性，影响成纤维细胞、巨噬细胞和肌纤维母细胞的募集、激活和增殖。激活的TGF-b 表现出超强的生长和分化特性，刺激成纤维细胞分化和细胞外基质蛋白的合成，通过单核细胞趋化蛋白-1 募集炎症细胞，激活T 细胞免疫应答反应。TGF-b 与TGF-bII 型受体( TGFbRII)结合后，再激活募集TGF-bI 型受体( TGFbRI) 组合后形成二聚体形式的受体复合物。TGFb-RII 磷酸化TGF-bRI 的甘氨酸-丝氨酸富集区域( GS 序列) 并活化TGF-bRI 的丝氨酸/苏氨酸活性。活化的TGFbRI反过来又磷酸化受体相关smad 蛋白。Smad2和Smad3 是受体调节因子，参与TGF-b 和活化素信号通路。R-Smads 和Smad4 主要位于细胞质中，它们的活性主要受衔接蛋白调节。Smad2 和Smad3直接被TGF-bRI 磷酸化，使得构象发生改变并从受体复合物中释放出来。Smad4 蛋白MH2 结构域识别R-SmadsC 端的磷酸丝氨酸，从而形成异质二聚体复合物( R-Smad /C-Smad) 。这些复合物转运至细胞核，核内Smad 蛋白与同源DNA 结合，吸附力较低，但在转录共激活因子的作用下可增强亲和性。Smad3 和Smad4 与DNA 的SBE 模序结合，而Smad2通过与Smad4 的相互作用与DNA 结合，激活相关细胞因子的转录。
　　动物实验显示，激活的TGF-b 在小鼠肺组织中过度表达，伴随着严重的间质和胸膜纤维化，主要表现为过多的胶原沉积，细胞外基质蛋白、纤维结合素、弹力蛋白在组织中富集和肌纤维母细胞的出现。TGF-b 在炎症的消退期可以直接诱导肺组织的纤维化，通过干预Smads 介导的信号通路，抑制TGF-b 活性，可以明显减轻肺纤维变性。
　　实验结果显示，补肾益肺消癥方可以明显下调IPF 大鼠外周血血清中TGF-b1 的含量，但对于细胞膜上受体TGF-bR1 基因表达无影响。该方可以明显下调TGF-b 信号传导通路中关键分子Smad2、3的表达，Smad4 蛋白表达有上调趋势。肺组织病理改变亦显示，该方可以明显抑制肺泡组织的破坏及组织纤维化增生，延缓肺纤维化的进程。由此我们可以认为，补肾益肺消癥方可以通过调控TGF-b 信号传导通路中关键分子基因和蛋白的表达，缓解免疫应答所导致的炎症反应及细胞外基质蛋白和胶原的沉积，从而抑制肺组织纤维化的进程，达到治疗效果。通过调控TGF-b 信号传导通路，缓解炎症反应并抑制肺组织纤维化是补肾益肺消癥方疗效的关键作用机制之一。