杨桃果提取物对CCl4所致小鼠急性肝损伤的保护措施

　　杨桃(Averrhoa carambola L)又名三廉、阳桃、五棱子、五敛子等，为酢浆草五敛子属热带常绿乔木，原产于东南亚的热带和亚热带地区，主要分布在我国广东、广西、福建、海南、台湾及云南等省区。杨桃是华南特产水果，果、根、叶和树皮均可入药，具有祛风热、生津止渴、利尿及解酒毒等作用。据李时珍本草纲目中记载：杨桃具有去风热、生津、止渴、解酒毒、止血拔毒生肌等多种功效。随着杨桃有效成分研究的逐步深入，其药理作用也越来越被人们所认识，如保肝等，为利用、保护杨桃资源开拓了新思路。
　　肝脏是人体重要的生物转化器官，也是毒物和药物排出体外前重要的清除器官。因此，极易受到毒性作用发生肝损伤。肝损伤是多因素参与的一个复杂病理过程，自由基及启动的脂质过氧化连锁反应是其主要机制之一。肖湘等采用化学发光法测定杨桃果提取物(YTGE)体外清除氧自由基的活性，结果表明，杨桃果具有清除O2-，OH和H2O2的作用。本实验研究YTGE对四氯化碳(CCl4)所致小鼠肝损伤的保护作用，探讨其可能的作用途径，为临床应用提供参考依据。
　　1 实验材料
　　1.1 实验动物：
　　昆明种小鼠，SPF级，雌雄各半，体重(202)g，由广西医科大学实验动物中心提供。实验动物生产许可证：SCXK桂2009-0002。常规鼠饲料喂养，自由饮水。
　　1.2 药物：
　　YTGE，由本实验室自行提取完成;加入蒸馏水配制成YTGE 高剂量(YTGEH)、YTGE 中剂量(YTGEM)、YTGE低剂量(YTGEL)，4 保存备用。联苯双酯滴丸：广州白云山星群(药业)股份有限公司，批号：JF40035 20131124。
　　1.3 试剂：
　　丙氨酸转氨酶(ALT，批号：20140115)和天冬氨酸转氨酶(AST，批号：20140115)检测试剂盒，超氧化物歧化酶(SOD，批号：20140212)，丙二醛(MDA，批号：2014021)，考马斯亮蓝(批号：20140113)检测试剂盒。均由南京建成生物工程研究所提供。
　　1.4 仪器：
　　光学显微镜、721紫外可见分光光度计UVmini-1240、EL204电子天平(上海特勒托多利多仪器有限公司)、TDL-5台式低速大容量离心机(上海安亭科学仪器厂)、TGL-16G-A 高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)、SHHW21.Cr600三用电热恒温水箱(北京长源实验设备厂)、RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。
　　2 实验方法
　　2.1 YTGE的提取和制备：
　　杨桃果洗净，把削理好的新鲜部分切成小块，称重，搅拌机打汁，4层纱布过滤，合并滤液，用旋转蒸发仪浓缩至2g生药/mL，4 保存。
　　2.2 分组与给药及模型制备：
　　取健康合格，体重(202)g的昆明种小鼠60只，随机分成6组，每组10只，即正常对照组、模型对照组(CCl4)、阳性[联苯双酯(150mg/kg)]对照组、YTGEL(5g生药/kg)组、YTGEM(10g生药/kg)组、YTGEH(20g生药/kg)组，每组10只，灌胃给药，正常对照组给予等容量的生理盐水。连续给药7d，期间所有小鼠均食用标准条状饲料，并观察记录其精神状态、反应活动、毛发光泽、食欲排泄、体质量变化等情况。末次给药后1h，正常对照组按0.2mL/10g的给药容量皮下腹腔注射生理盐水，其余各组按相同的给药容量腹腔注射0.2% CCl4花生油溶液(0.2mL/10g)，禁食不禁水约20h。摘眼球取血，处死动物，剖腹取出肝脏，取肝大叶相同部位的小块肝组织用10%福尔马林溶液固定;另外，切取适量肝组织，以生理盐水制备成10%匀浆，3 500r/min离心15min，吸取上清液，-20 冻存。将凝固的血液于3 000r/min离心10min，分离血清，-20 冻存。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学要求。
　　2.3 血清AST、ALT的测定：
　　严格按试剂盒说明书的要求测定血清中的AST(2，4-二硝基苯肼法)、ALT(2，4-二硝基苯肼法)。
　　2.4 肝组织MDA和SOD的测定：
　　严格按试剂盒说明书的要求测定肝组织匀浆中SOD(羟胺法)、MDA。
　　2.5 肝组织病理损伤观察：
　　10%福尔马林溶液固定的肝组织经常规脱水，石蜡包埋，切片和HE染色后在显微镜下观察病理改变。
　　2.6 统计学分析：
　　采用SPSS 16.0软件对数据进行统计学分析，计量资料采用珚xs表示，组间比较采用单因素方差分析，多组间的两两比较采用SNK-q检验;P 0.05为差异有统计学意义。
　　3 结 果
　　3.1 YTGE对CCl4
　　所致急性肝损伤小鼠血清ALT、AST的影响：模型对照组小鼠血清ALT与AST的含量均显著升高，与正常对照组比较差异有统计学意义(P 0.01)，说明造模成功。阳性对照组、YTGEH、YTGEM、YTGEL组血清ALT和AST含量均低于模型对照组，与模型对照组比较差异有统计学意义(P 0.01或P 0.05)。3.2 YTGE对CCl4所致急性肝损伤小鼠肝组织中SOD、MDA的影响：CCl4诱导急性肝损伤后，肝组织中的MDA含量升高，SOD活性降低。与模型对照组比较，阳性对照组与YTGE各剂量组均可显著降低小鼠肝组织MDA含量(P 0.01和P 0.05)。模型对照组小鼠肝组织中SOD活力显著降低(P 阳性对照组与YTGE各剂量组均可显著升高小鼠肝组织SOD活力(P 0.01和P 0.05)。
　　3.3.1 肉眼观察：
　　正常对照组小鼠肝脏组织呈鲜红色，外表光滑亮泽，质地柔软，富有弹性;模型对照组小鼠肝脏组织呈暗红色，表面粗糙，缺乏弹性，体积肿大，而其他各组小鼠肝脏病变较模型对照组为轻。
　　3.3.2 光镜观察：
　　正常对照组小鼠基本无异常;模型对照组小鼠肝小叶中央区明显灶状坏死，细胞不圆整，结构不清晰，细胞核较小，出现水肿和气球样变，有大量脂肪变性，细胞间质有炎性细胞浸润;YTGE各剂量组和阳性对照组中肝组织炎性细胞浸润减轻，肝细胞变性、坏死等病理性损伤均有不同程度的缓解。表明YTGE对CCl4致小鼠急性肝损伤有很好的保护作用，能明显减轻CCl4对肝脏的病理损伤。
　　4 讨 论
　　脂质过氧化是CCl4急性肝损伤的主要机制，CCl4经过CytP450亚族CytP450E1活化后生成三氯甲基自由基(CCl3)，此后CCl3可启动过氧化连锁反应，产生毒性作用更强的二氯甲基自由基(CCl2)及过氧化甲基自由基(OOCCl3)。肝细胞膜的不饱和脂肪酸受这些自由基攻击，引发脂质过氧化，导致肝细胞变性坏死或肝细胞通透性增强，细胞质内转氨酶渗出，导致血清中的ALT和AST含量上升，可见通过检测血清ALT、AST活性在一定范围内反映肝细胞的损伤程度[11]。SOD是机体防御新陈代谢及其它生命活动中氧自由基损伤和破坏的一种重要金属酶，能使自由基发生歧化反应，阻止CCl4进入机体后生成CCl3破坏肝细胞[12]。MDA为脂质过氧化的终产物，组织中MDA 含量的多少可衡量该组织过氧化损伤的程度。因此，通过对肝组织SOD和MDA 的检测，可以反映肝脏脂质过氧化损伤的程度。
　　本实验结果显示，YTGE能明显降低CCl4急性肝损伤引起的ALT、AST升高，可降低MDA量，提高肝组织SOD活性，减轻肝细胞的变性坏死和炎性浸润等病理变化，提示YTGE可提高CC14致急性肝损伤小鼠的抗氧化能力，减轻肝脏病理损伤。
　　综上所述，YTGE对CCl4所致小鼠急性肝损伤有保护作用，其机制可能与其抗自由基、抑制脂质过氧化作用有关。至于YTGE对肝损伤的保护作用是否还存在其它机制，尚需进一步深入研究。