小球藻提取物对CCl4所致小鼠急性肝损伤的作用讨论

　　肝脏是机体重要的代谢器官，是化学毒物或药物在体内代谢或转化的重要场所，因此肝脏极易受到外源性物质的攻击，从而引发急性或慢性损伤。目前，肝病已成为我国最突出的公共卫生问题之一，是与艾滋病、肺结核和血吸虫病并列危害最严重的四大传染疾病之一。因而，研究抗肝脏疾病的有效功能性食品成分或药物显得犹为重要。
　　小球藻（Chlorellavulgaris）是一类普生性球形单细胞绿藻，生态分布极广，在淡水、海水中均有发现。小球藻含有丰富的蛋白质、多糖、脂质、叶绿素、维生素、微量元素、核酸和一些生物活性代谢产物，有药物藻类之美誉。研究表明，小球藻具有激活淋巴细胞、增强免疫力、抵抗外来疾病的入侵、促进人体受伤组织修复等功效，降血压、降血脂、抗氧化、抗肿瘤、解毒等功效。四氯化碳（CC14）是一种常见的肝毒性化合物，可诱导急性肝损伤、肝纤维化、肝硬化和肝癌等肝脏疾病的发生，常用于实验室急性肝损伤的造模。本实验通过CC14致小鼠肝损伤模型，探讨小球藻水提物对小鼠急性肝损伤的保护作用与机制，以期为小球藻功能性食品的开发及应用提供实验依据。
　　1材料与方法
　　1。1材料
　　四氯化碳（CCl4），Sigma；玉米油；丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒，Biochem；天冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒，Biochem；BioPlexMultiplex细胞因子试剂盒，BioRad。
　　1。2实验动物
　　健康雄性ICR小鼠60只，体重（2025g）。小球藻由韩国MarineMicroalgaeCultureCenter提供。
　　1。3小球藻水提物的制备
　　将500g干燥的小球藻粉混悬于适量蒸馏水中，90，30min，提取两次，合并提取液，离心60min，上清液用1m玻璃纤维滤器过滤后，冷冻干燥，得粗粉63g，于20保存备用。
　　1。4动物分组及给药方法
　　健康雄性ICR小鼠60只，随机分为正常组，模型组，小球藻水提物大剂量组、中剂量组、小剂量组和水飞蓟素阳性对照组6个组，每组10只，隔天灌胃给药。小球藻水提物给药组分别按50，100，200mgkg小球藻水提物灌胃，阳性对照组按100mgkg水飞蓟素灌胃，正常组、模型组按等体积生理盐水灌胃，共30d。末次给药1h后，模型组和给药组腹腔注射20mgkgCCl4玉米油溶液（2mLkg），正常组腹腔注射等体积玉米油溶液，禁食，不禁水。24h后乌拉坦麻醉，下腔静脉取血，离心后取得血清，置于20保存。采血后迅速摘除肝脏，用冷PBS缓冲液洗涤干净，滤纸吸干水分后，80保存。
　　1。5血清学指标检测
　　应用全自动生化分析仪测定小鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）及草氨酸氨基转移酶（AST）的水平。
　　1。6病理学指标检测
　　于肝左叶取材，10福尔马林固定，石蜡包埋，5m连续切片，HE染色，光镜下观察观察各组小鼠肝脏组织学变化，肝细胞变性坏死，炎性浸润等，并拍照。
　　1。7小球藻水提物对炎性细胞因子分泌影响
　　取肝脏匀浆上清，按照BioRad公司试剂盒说明书，使用Luminex100analyzer（LuminexCorp。，Austin，TX）进行炎性细胞因子TNF含量测定，利用MasterPlexQTAnalysisversion2（MiraiBio，Alameda，CA）制作标准曲线进行定量。1。8统计学处理本文中的各项实验每组均重复3次以上，数据用MeanSD表示，结果比较采用单因素方差分析和ANOVA检验统计分析。p0。05为差异有显著性意义。
　　2结果
　　2。1小球藻水提物对CCl4所致肝损伤小鼠血清ALT及AST活性的影响
　　与正常对照组比较，肝损伤模型组小鼠血清ALT及AST水平明显升高，说明造模成功。给予小球藻提取物预保护的实验组小鼠血清ALT及AST水平均显著低于模型组，且随给予小球藻水提物的剂量增加，ALT及AST降低水平呈剂量依赖趋势。
　　2。2病理学检测结果HE
　　病理切片在显微镜下观察，正常对照组肝小叶结构完整清晰，肝细胞以中央静脉为中心呈条索状向四周放射状排列，排列整齐，无坏死及脂肪变性（A）；CCl4模型组肝组织明显损伤，肝细胞浊肿、气球样变性，大部分正常肝小叶结构破坏或消失，肝细胞脂肪变性及坏死严重（B）。阳性药水飞蓟素组肝细胞浊肿减轻，坏死灶减少，汇管区炎细胞浸润减轻（C）。与模型组比较，给药低、中、高剂量组肝组织损伤均有不同程度的减轻，灶状坏死灶减少，较少肝细胞脂肪变性，浊肿、气球样变及间质炎症减轻（DF），其中高剂量组较低、中剂量组效果好。
　　2。3小球藻水提物对CCl4所致肝损伤小鼠肝脏细胞因子分泌的影响
　　对各组肝匀浆进行炎性细胞因子TNF检测，结果显示如图，CCl4能够有效刺激肝细胞分泌炎性细胞因子TNF，与正常对照组相比有显著性差异（p0。01）。小球藻水提物干预时，TNF产生的量显著降低，显示了小球藻水提物对CCl4诱导的炎性细胞因子分泌的抑制作用，且呈剂量依赖性增加（p0。05）。
　　3讨论
　　肝脏是机体重要的代谢器官，在糖类、脂类及蛋白质代谢过程中起着重要作用。CCl4是一种典型的化学性肝损伤诱导剂，本实验采用腹腔注射CCl4建立小鼠急性肝损伤模型，研究小球藻水提物对肝损伤的保护作用及可能的机制。ALT和AST是肝脏代谢的主要酶类，当肝细胞有炎症或受到损伤时，肝细胞膜通透性增加，线粒体受损，血液中ALT及AST升高，因此，检测血清ALT和AST水平是检验肝细胞操作程度的灵敏而特异性指标。本研究结果显示，小球藻水提物可明显抑制CCl4引起的小鼠血清ALT及AST水平上升，并呈剂量依赖趋势。同时，通过肝组织病理学观察，小球藻水提物干预后，小鼠肝细胞无大量坏死，炎性浸润减少，肝细胞脂肪变性降低，表明小球藻水提物对肝脏损伤具有保护作用。炎性反应对机体的影响是一把双刃剑。在炎性反应发生初期，当巨噬细胞受到相应刺激后便会被激活，这些活化的巨噬细胞可分泌TNF。TNF是一种多功能的促炎性细胞因子，能够刺激一系列促炎物质，如IL1等的产生〔67〕，TNF在诱导肝脏炎症和引起肝脏损伤过程中发挥重要作用〔8〕，因此，降低促炎性细胞因子TNF能够缓解CCl4造成的肝脏炎症。本实验结果显示，小球藻水提物降低了TNF的含量，该结果显示小球藻水提物具有降低肝脏炎症的作用，从而实现对肝损伤的保护作用。
　　4结论
　　本实验研究结果表明，小球藻水提物对CCl4造成的急性肝脏损伤具有一定的保护作用，能够降低炎性细胞因子的分泌，提示小球藻水提物可能对相关炎症疾病具有保护作用。这些研究为小球藻水提物用于防治炎症提供一定的依据，但是其在分子水平的作用机理还有待进一步研究。