关于大鼠羊膜细胞体外培养及其干细胞标记物的表达

　　羊膜位于胎盘绒毛膜内侧，是一层无血管、神经、淋巴和肌肉的透明薄膜，可起到对胎儿的保护作用，与发育中的胎儿联系紧密。人源羊膜细胞在受精后第8天开始形成，具有多项分化的潜能，可向三个胚层细胞进行分化，近年来研究表明，羊膜上皮细胞能够分化为成熟的神经细胞，并合成释放多巴胺、乙酰胆碱、去甲肾上腺素等神经递质。人羊膜细胞具有低免疫原性和有效的免疫抑制力，细胞移植后不会发生急性排斥反应。本实验从大鼠羊膜分离获取羊膜细胞，建立稳定培养的条件，并对其生物学特性进行了探讨，为其将来在细胞移植治疗方面的应用提供实验依据。
　　1材料和方法：
　　1。1材料
　　1。1。1主要仪器：CO2培养箱、净化工作台、倒置显微镜、倒置荧光显微镜、共聚焦荧光显微镜、流式细胞仪。
　　1。1。2主要试剂：DMEM高糖培养基（DulbeccosmodifiedEaglesmedium，DMEM）、人表皮生长因子（EGF）、0。25含EDTA的胰蛋白酶（0。25trysinEDTA）、胎牛血清（fetalbovineserum，FBS）、抗生素（penicillin，streptomycin）、PBS缓冲液购自于Gibco公司。Oct4、Sox2、SSEA4、nestin、vimentin、BDNF、NGF、CD90购自与Abcam公司。CD29、CD44购自于eBioscience公司、CD45、CD11b购自于BD公司。
　　1。1。3实验动物：SPF级孕1818。5d的SD大鼠，购自中国军科院实验动物中心，许可证号：〔SCXK（军）20140004〕，实验动物使用批准号：ILASPL2014001。在无菌条件下进行实验操作分离羊膜组织。
　　1。2方法
　　1。2。1羊膜细胞分离及培养：SD孕鼠腹腔注射1戊巴比妥钠（0。01mLg），麻醉后，无菌条件下开腹，机械性分离子宫层，剥离胎盘，分离羊膜组织置于含有500UmL双抗的PBS溶液中冲洗。将羊膜组织放置在含有500UmL双抗的DMEM基础培养基中，无菌眼科剪将其剪至1mm3左右的小块。将组织悬液移至50mL离心管中，1000rmin离心5min，弃上清液。加入0。25含EDTA的胰蛋白酶10mL，37，5CO2条件下消化2030min。用含有10胎牛血清的完全培养基终止消化。200目不锈钢滤网过滤单细胞悬液，接种至25cm2培养瓶，含10FBS、10gLEGF和500UmL双抗的DMEM完全培养基培养，隔天细胞换液，23d后细胞长满培养瓶8590时，进行细胞传代。
　　1。2。2流式细胞术检测：取培养24代细胞，用0。25含EDTA的胰蛋白酶消化，含10FBS的DMEM完全培养基终止消化。细胞计数将其稀释成1106个，每个流式管1mL细胞悬液。每流式管加2mLPBS使细胞混匀，2000rmin离心5min，弃上清液。重复加2mLPBS重悬细胞，2000rmin离心5min，弃上清液。每管加50LPBS重悬细胞，加抗体CD29PECy7、CD44PE、CD90FITC、CD45PECY7、CD11bAPC，避光室温孵育30min。每管加2mLPBS重悬细胞2000rmin离心5min，弃上清液。各管加300LPBS重悬细胞上机检测。
　　1。2。3免疫荧光细胞染色：取24代细胞，0。25含EDTA胰蛋白酶消化，含10FBS的DMEM完全培养基终止消化。加入完全培养基重悬，至24孔板中培养。待细胞增殖至70作用时，PBS冲洗，4多聚甲醛（预冷）固定10min。PBS冲洗2次，每次5mim。1Tuiton100孵育10min。PBS冲洗2次，每次5mim。山羊血清工作液每孔100L室温下封闭30min。吸去山羊血清工作液，抗体稀释液稀释抗体Oct4（1200）、Sox2（1200）、SSEA4（1200）、nestin（1100）、vimentin（1100），每孔100L，4过夜孵育。PBS冲洗3次，每次5min。避光条件下，PBS稀释FITC标记的羊抗鼠二抗（1200），37避光孵育30min。PBS冲洗3次，每次5min。DAPI封片剂封片。共聚焦荧光显微镜观察。
　　1。3统计学方法实验结果采用x珋s表示，使用SPSS15。0统计软件进行统计处理，对其进行单因素方差分析和LSD检验，P0。05表示差异具有统计学意义。
　　2结果
　　2。1分离细胞培养分离培养大鼠羊膜细胞，镜下，细胞呈变形虫样生长（图1a），生长速度快（图1b），需隔天换液传代。本实验中大鼠羊膜细胞可传至67代。
　　2。2流式细胞术鉴定细胞表面抗原结果经流式细胞术鉴定大鼠羊膜细胞间充质细胞表面标记物CD29、CD44分别为97。6和95。8。细胞表面抗原CD90、CD45几乎不表达，CD11b有少量表达（图2见文后彩插6）。
　　2。3细胞免疫荧光鉴定细胞表面标记物结果本实验通过细胞免疫荧光方法检测大鼠羊膜细胞表达干细胞标记物Oct4和Sox2（如图3），神经干细胞标记物nestin和间充质干细胞标记物vimentin（如图4），（图34见文后彩插7）并表达胚胎干细胞标记物SSEA4（如图5）。可表达神经营养因子BDNF和NGF（如图6）（图56见文后彩插8）。
　　3讨论
　　通过细胞免疫荧光实验发现大鼠羊膜细胞表达干细胞表面标记物Oct4和Sox2，间充质细胞标记物vimentin和神经细胞标记物nestin，表达SSEA4。可表达神经营养因子标记物BDNF和NGF，这些神经营养因子是神经元生长与存活所必需的蛋白质分子。羊膜细胞表达间充质干细胞标记物CD29和CD44，其表达量均在95以上，CD45、CD90几乎不表达，CD11b有少量表达。Oct4可参与胚胎干细胞的自我更新，调节胚胎干细胞的多分化潜能。有研究指出Oct4在羊膜细胞核内及细胞质均可表达。Miki等人研究结果表明人羊膜上皮细胞和间充质细胞都可表达Sox2、Oct4等干细胞标志物。本实验结果显示在大鼠羊膜细胞中Oct4在胞核和胞质中均有表达。Nestin被认为是在胚胎和成体组织中的多能性神经干细胞的标记物。在有丝分裂活跃的中枢神经系统和周围神经系统细胞中表达，现作为神经干细胞的标记物被广泛应用。人羊膜来源的间充质干细胞经体外诱导分化，可分化为神经样细胞并表达nestin、Oct4和Sox2。Vimentin起到维持细胞形态，胞质完整性和稳定细胞骨架的作用。有研究发现在妊娠15d的大鼠胚胎中检测有nestin和vimentin的表达，人羊膜细胞未分化的前体细胞中也存在nestin、vimentin表达。
　　有研究发现大鼠羊膜细胞和人羊膜细胞中都表达nestin和vimentin因子。SSEA4被认为是特异性人胚胎干细胞和卵泡期胚胎早期卵裂的标记物，也被视为成体间充质干细胞的标记物。Ilancheran等与他的同事MIKI等分别通过实验证明了人羊膜上皮细胞表达胚胎干细胞表面标记物SSEA4。本实验通过细胞免疫荧光方法检测出大鼠羊膜细胞表达nestin、vimentin和SSEA4。NGF和BDNF都是神经营养因子家族中成员。NGF同时也是一种信号分子，缺乏NGF对神经元的营养作用，神经元会出现凋亡。BDNF可促进神经元的存活并能支持神经元和突触的生长和中国比较医学杂志2015年4月第25卷第4期ChinJCompMed，April2015，Vol。25。No。436分化。BDNF可减少突触丧失、矫正部分异常基因表达、阻止神经元萎缩且改善与年龄相关的认知障碍，提高学习记忆能力。研究人员发现人羊膜上皮细胞和人羊膜间充质细胞可合成释放神经营养因子BDNF、NGF和NT3，其他的神经营养因子通过细胞培养后检测没有表达。多个实验证实通过移植人羊膜细胞到损伤部位能修复受损伤的神经元，BDNF的表达水平同时增加，说明人羊膜细胞很可能通过释放BDNF来修复损伤神经元的功能。本实验中通过细胞免疫荧光方法也发现大鼠羊膜细胞表达神经营养因子BDNF和NGF。
　　人羊膜间充质细胞可表达间充质细胞标记物CD29、CD44、CD73、CD90、CD166和CD105，不表达骨髓造血标记物CD34和CD45、单核细胞标记物CD114和巨噬细胞标记物CD11b。Murphy等在研究人羊膜上皮细胞特点时发现，人羊膜上皮细胞表达上皮粘附分子EpCAM，几乎不表达CD90和CD105。而人羊膜间充质细胞表达CD90、CD73和CD105，其表达量都在95以上，CD45、CD34表达量少于2。Bailo等发现人羊膜细胞表达CD105、CD73、CD90和CD29，不表达CD34、CD45、CD14和CD3〔18〕。本实验中通过流式细胞术方法检测到大鼠羊膜细胞表达CD29和CD44，不表达CD90、CD45，少量表达CD11b。羊膜细胞易于分离培养，细胞生长速度快，免疫原性低，并有向三个胚层分化的潜能，在相关疾病的治疗中具有很好的前景。本实验较为系统地检测了大鼠羊膜细胞的四类干细胞标记物，发现大鼠羊膜细胞可表达干细胞表面标记物Oct4和Sox2、胚胎干细胞标记物SSEA4、间充质干细胞标记物vimentin和神经干细胞标记物nestin，并同时还表达神经生长因子BDNF和NGF。由此，我们推测大鼠羊膜细胞很可能具有某些间充质干细胞和神经干细胞的特性，为相关基础研究和神经系统疾病的治疗提供了一些线索。