简便有效分离培养大鼠主动脉内皮细胞的一种新方法

　　毕业论文作者：肖琼房云海徐蕴田铧张立平田兴松
　　【摘要】目的：探索分离、培养鼠主动脉内皮细胞的有效方法。方法：将鼠主动脉内膜翻向外，结扎两端，置于50mL培养瓶中培养、传代，因子相关抗原免疫细胞化学染色。结果：培养68d时有少量细胞自主动脉迁移出并贴壁生长；1214d时贴壁细胞覆盖大部分培养瓶面，约80的细胞汇合成单层；传代细胞生长旺盛；细胞汇合后呈现典型的鹅卵石样内皮细胞特征，内皮细胞标志物因子相关抗原表达阳性；未见杂细胞。结论：此方法无损伤、不需要酶消化，能比较容易的获得高纯度大鼠原代主动脉内皮细胞，适用于细小血管内皮细胞的分离与培养。
　　【关键词】主动脉体外培养内皮细胞大鼠
　　Anewmethodforisolationandcultureoftheendothelialcellsoftherataorta
　　【ABSTRACT】Objective：Toinvestigateamodifiedmethodofisolatingandculturingtheendothelialcellsfromtherataortaforendothelialbioresearch。Methods：Turnedinsideout，theaortaoftherat，ofwhichtheintimatunicawasexposed，wasligatedatbothendsandculturedina50mLculturebottle。Results：Asmallamountofcellsmigratedoutfromtheaorta6to8daysaftercultured；themigratingcellsspreadovermostoftheculturesurfaceofthebottle12to14daysaftercultured，80oftheminaconfluentmonolayer。Theconfluentcellswereidentifiedasendothelialcellswiththetypicalcobblestoneappearanceandthepositivereactionforfactorrelativeantigen，noothertypesofcellswasobserved。Conclusion：Thisisawoundless，nonenzymaticmethodofobtaininghighlypurifiedprimaryendothelialcellsoftherataorta，especiallypracticalforisolationandcultureofsmallvascularendothelialcells。
　　内皮细胞是研究心血管、炎症、肿瘤等疾病最常用的工具。目前，对脐静脉等较大血管原代内皮细胞的分离与培养1般采用酶消化法，技术已经成熟。但对于大鼠等小动物血管而言，由于管径细小，操作难度大，其内皮细胞的分离与培养1直存在产量少、易混入杂细胞等问题1。本研究经过反复实验，建立了1种有效获取高纯度、高数量大鼠原代血管内皮细胞的分离与培养方法。
　　1材料与方法1。2培养方法1。2。细胞传代培养原代培养约1214d，迁出生长的细胞覆盖培养瓶面积的23以上，约80的细胞汇合即可传代。取出主动脉，用DHanks液冲洗培养瓶2次，常规消化、吹打，1000rmin离心5min，弃上清，加入含10胎牛血清的DMEMF12培养液适量，制成细胞悬液，依照细胞的量按1：1或1：2传代培养，3d换液1次。另9只大鼠以同样步骤重复上述实验。1。4细胞纯度分析取6次培养的第2代主动脉内皮细胞，vWF免疫细胞化学染色后，每张盖玻片400倍镜下随机选5个视野计数细胞，计算细胞阳性表达率（细胞阳性表达率阳性细胞数细胞总数）。
　　2结果2。2免疫细胞化学染色vWF免疫细胞化学染色，细胞质呈现棕黄色阳性反应。每张盖玻片100倍镜下随机选10个视野进行观察，均未见染色阴性表达细胞（图2）。
　　2。3细胞纯度分析vWF免疫细胞化学染色后，每张盖玻片400倍镜下随机选5个视野计数细胞，所见细胞均为阳性染色细胞，阳性表达率为100，即获取的内皮细胞纯度为100。
　　重复实验10次，均获得同样结果。
　　〔NextPage〕
　　3讨论酶消化法可以在相对短的时间内获取细胞。大鼠主动脉较细，本实验发现150g的大鼠主动脉管径约2mm，其分支非常细且不易结扎，灌注的酶消化液容易经其分支渗漏至管外，使外膜也被消化，导致其他细胞混入；细胞产量亦较低，且大多需同时获取多条动脉，操作复杂；有时因酶的活性改变而使消化时间难以掌控，不仅影响内皮细胞的分离和提取，亦可直接影响内皮细胞的活力7。
　　组织块移植培养法操作简单，对细胞活力无损伤，缺点为长出的细胞成分比较复杂，内皮细胞纯度低8，常伴有成纤维细胞污染。由于成纤维细胞生长迅速，最终过度生长甚至覆盖内皮细胞而影响内皮细胞增殖。有学者将大鼠主动脉外膜做瞬间热处理后再进行植块培养，提高获取内皮细胞的纯度至67。86。此方法解决了鼠主动脉内皮细胞难获取的问题，也适用于其他较大动物细小血管内皮细胞的分离与培养，为进1步研究其内皮细胞的生物学特性及其相关疾病提供了良好平台。
　　【参考文献】
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