简便有效分离培养大鼠主动脉内皮细胞的一种新方法

　　毕业论文 作者：肖琼 房云海 徐蕴 田铧 张立平 田兴松
　　【摘要】  目的：探索分离、培养鼠主动脉内皮细胞的有效方法。方法：将鼠主动脉内膜翻向外，结扎两端，置于50 mL培养瓶中培养、传代，Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色。结果：培养6 8 d 时有少量细胞自主动脉迁移出并贴壁生长；12 14 d 时贴壁细胞覆盖大部分培养瓶面，约80%的细胞汇合成单层；传代细胞生长旺盛；细胞汇合后呈现典型的＂鹅卵石＂样内皮细胞特征，内皮细胞标志物Ⅷ因子相关抗原表达阳性；未见杂细胞。结论：此方法无损伤、不需要酶消化，能比较容易的获得高纯度大鼠原代主动脉内皮细胞，适用于细小血管内皮细胞的分离与培养。
　　【关键词】  主动脉·体外培养·内皮细胞·大鼠
　　A new method for isolation and culture of the endothelial cells of the rat aorta
　　【ABSTRACT】Objective:To investigate a modified method of isolating and culturing the endothelial cells from the rat aorta for endothelial bioresearch. Methods:Turned inside out, the aorta of the rat,  of which the intima tunica was exposed, was ligated at both ends and cultured in a 50 mL culture bottle. Results:A small amount of cells migrated out from the aorta 6 to 8 days after cultured; the migrating cells spread over most of the culture surface of the bottle 12 to 14 days after cultured, 80% of them in a confluent monolayer. The confluent cells were identified as endothelial cells with the typical cobblestone appearance and the positive reaction for factor Ⅷ relative antigen, no other types of cells was observed. Conclusion:This is a woundless, nonenzymatic method of obtaining highly purified primary endothelial cells of the rat aorta, especially practical for isolation and culture of small vascular endothelial cells.
　　内皮细胞是研究心血管、炎症、肿瘤等疾病最常用的工具。目前，对脐静脉等较大血管原代内皮细胞的分离与培养1般采用酶消化法，技术已经成熟。但对于大鼠等小动物血管而言，由于管径细小，操作难度大，其内皮细胞的分离与培养1直存在产量少、易混入杂细胞等问题 ［1］。本研究经过反复实验，建立了1种有效获取高纯度、高数量大鼠原代血管内皮细胞的分离与培养方法。
　　1 材料与方法    1.2 培养方法    1.2.２ 细胞传代培养 原代培养约12  14 d，迁出生长的细胞覆盖培养瓶面积的2/3以上，约80 %的细胞汇合即可传代。取出主动脉，用D-Hanks液冲洗培养瓶2次，常规消化、吹打，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入含10% 胎牛血清的DMEM/F12培养液适量，制成细胞悬液，依照细胞的量按1：1或1：2传代培养，3 d换液1次。另9只大鼠以同样步骤重复上述实验。    1.4 细胞纯度分析 取6次培养的第2代主动脉内皮细胞，vWF免疫细胞化学染色后，每张盖玻片400倍镜下随机选5个视野计数细胞，计算细胞阳性表达率（细胞阳性表达率=阳性细胞数/细胞总数）。
　　2 结果    2.2 免疫细胞化学染色 vWF免疫细胞化学染色，细胞质呈现棕黄色阳性反应。每张盖玻片100倍镜下随机选10个视野进行观察，均未见染色阴性表达细胞（图2）。
　　2.3 细胞纯度分析 vWF免疫细胞化学染色后，每张盖玻片400倍镜下随机选5个视野计数细胞，所见细胞均为阳性染色细胞，阳性表达率为100%，即获取的内皮细胞纯度为100%。
　　重复实验10次，均获得同样结果。
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　　3 讨论      酶消化法可以在相对短的时间内获取细胞。大鼠主动脉较细，本实验发现150 g的大鼠主动脉管径约2 mm，其分支非常细且不易结扎，灌注的酶消化液容易经其分支渗漏至管外，使外膜也被消化，导致其他细胞混入；细胞产量亦较低，且大多需同时获取多条动脉，操作复杂；有时因酶的活性改变而使消化时间难以掌控,不仅影响内皮细胞的分离和提取，亦可直接影响内皮细胞的活力［7］。
　　组织块移植培养法操作简单，对细胞活力无损伤，缺点为长出的细胞成分比较复杂，内皮细胞纯度低［8］，常伴有成纤维细胞污染。由于成纤维细胞生长迅速，最终过度生长甚至覆盖内皮细胞而影响内皮细胞增殖。有学者将大鼠主动脉外膜做瞬间热处理后再进行植块培养，提高获取内皮细胞的纯度至67.8%［6］。      此方法解决了鼠主动脉内皮细胞难获取的问题，也适用于其他较大动物细小血管内皮细胞的分离与培养，为进1步研究其内皮细胞的生物学特性及其相关疾病提供了良好平台。
　　【参考文献】
　　［1］ Cole OF, Fan TP, Lewis GP. Isolation, characterization, growth and culture of endothelial cells from the rat aorta[J]. Cell Biol Int Rep, 1986, 10
　　（6）:399-405.［3］ Battle T, Arnal JF, Challah M, et a1. Selective isolation of rat aortic wall layers and their cell types in culture-application to converting enzyme activity measurement [J]. Tissue Cell, 1994, 26
　　（6）:943-955.［5］ Lincoln DW, Larsen AM, Phillips PG, et al. Isolation of murine aortic endothelial cells In culture and the effects of sex steroids on their growth[J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 2003, 39（3-4）:140-145.
　　［6］ 林哲绚，罗文鸿，李慧．瞬间热处理大鼠主动脉内皮细胞分离培养法[J]．解剖学杂志，2004，27
　　（5）：571-573．
　　［7］ 李淑香，王佐周，邱雪杉．酶消化对培养脐静脉内皮细胞的影响[J]．解剖科学进展，2000，6
　　（2）：186．
　　［8］ Nicosia RF, Villaschi S, Smith M. Isolation and characterization of vasoformative endothelial cells from the rat aorta[J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 1994, 30A
　　（6）:394-399.