Nature子刊使用自动化和机器学习的高通量微生物培养组学

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　　近期，ChatGPT在问答领域十分火热，ChatGPT的背后是人工智能(AI)的功劳。当前，人工智能已经被广泛应用与科学研究中，随着人工智能和深度学习模型的最新进展被训练成识别多维成像和生物数据中的细微差别特征，结合表型和基因组数据流的机器学习(ML) 有望改变下一代微生物培养物。宏基因组学提供了广泛调查从土壤群落到肠道微生物组的各种微生物生态系统组成的能力。然而，微生物需要被分离和培养，以机械地剖析它们在栖息地中的功能作用以及发生的无数种间过程。依靠＂蛮力＂随机摘菌落的传统栽培方法繁琐且劳动密集。传统的使用 96 或 384 孔的基于稀释的连续分离方法是资源密集型的，导致从群体中重复分离相同的优势菌株 。 微流体系统能够在纳升反应器中生长，但克隆分离株难以提取。鉴于典型的微生物组可能包含数百到数千种表现出长尾丰度分布的独特物种（即，很少占主导地位，而大多数是罕见的），通过系统培养组学生成全面的菌株集合仍然是一个重要而突出的挑战 。
　　来自美国哥伦比亚大学的Harris H. Wang团队开发了一个开源的高通量机器人菌株分离平台，可用于按需快速生成分离物 。本研究开发了一种机器学习方法，利用菌落形态和基因组数据来最大限度地提高分离出的微生物的多样性，并能够有针对性地挑选特定的属。将该平台应用于20名人类的粪便样本，产生了个性化的肠道微生物生物库，总计26997个分离物，占所有丰富分类群的80%以上。对超过100000个目测捕获的菌落的空间分析揭示了反刍球菌科、类杆菌科、芽孢杆菌科和双歧杆菌科之间的共生模式，表明了重要的微生物相互作用。这种培养组学框架应使新的研究工作能够系统化基于成像的表型的收集和定量分析，并为许多新兴微生物组研究提供高分辨率基因组学数据。相关工作以题为＂High-throughput microbial culturomics using automation and machine learning＂的文章发表在2023年2月20日的国际顶级期刊《Nature biotechnology》。
　　1. 创新型研究内容
　　CAMII平台包括四个关键要素(图1):(1)收集菌落形态数据的成像系统和人工智能引导的菌落选择算法；(2)用于高通量分离和排列分离株的自动菌落挑选机器人；(3)用于快速生成所选分离株基因组数据的成本效益渠道；(4)具有可搜索菌落形态、表型和基因型信息的物理分离生物库和数字数据库。因此，这种端到端的培养组学平台可以从不同的输入微生物组中产生分离的收集物，以最大限度地减少人工劳动。整个成像和隔离系统采用了安装在厌氧室中的现有组件，可实时控制温度、湿度和氧气水平。CAMII机器人的隔离通量为每小时2000个菌落，每次运行可处理12000个菌落，比人工隔离菌落的能力高20倍 ，速度更快。为了确保本研究的基因组分析能力与机器人分离通量相匹配，还开发了一种低成本、高通量测序管道，利用液体处理自动化来生成16S rRNA测序或全基因组测序的条形码文库。在Illumina HiSeq平台上，每个分离物的菌落分离和基因组DNA (gDNA)制备成本为0.45美元，16S rRNA测序成本为0.46美元 ，而商业化的覆盖>60 的WGS成本为6.37美元 ，这 比当前的商业服务便宜得多 。另外，CAMII平台的一个关键独特特征是成像系统，该系统收集并学习细菌菌落的形态数据。具体而言，显示菌落高度、半径和圆形度的透照图像和显示颜色和复杂形态特征(如起皱)的落射图像在CAMII上捕获，以产生多维和可量化的形态数据集。本研究开发了一个定制的菌落分析管道，可以沿着不同的形态特征分割菌落。
　　图1 一种利用表型和形态特征的数据驱动微生物分离策略
　　虽然来自不同人的微生物组可能共享相似的细菌种类，但属于这些种类的菌株对于个体来说是高度独特的，并且可能在同一宿主中共殖多年。本研究展示了CAMII产生20名健康人的个性化肠道分离物集合的效用。分析了总共102071个菌落，挑选26997个菌落并通过16S rRNA测序进行分类鉴定(图2)，产生394个独特的ASVs，其覆盖了健康共生肠道微生物组的广泛多样性。为了评估该分离物收集的全面性，本研究通过批量16S rRNA测序计算了相应粪便样品中分离的ASV的丰度。值得注意的是，对于每个个体，有80.9 9.4%的ASV在整个分离物集合中至少出现一次。来自每个人的分离物平均构成该个体中细菌ASV总丰度的45.6 21.6%。此外，分离物收集物和大量粪便样本的比较显示:大多数高度丰富和流行的ASV在收集物中至少被分离一次。先前的研究发现，许多来自不同环境的微生物很难在实验室中培养。因此，本研究探究了利用本研究的系统生成的分离物生物库来评估人类肠道微生物组的可培养性，并在实验环境中识别仍然难以分离的细菌ASV。在所有20个个性化分离物收集物中，确定了是否在生物库中发现了大量粪便物质中的丰富ASV (平均相对丰度> 0.1%)。
　　图2 为20个人生成个性化肠道隔离生物库
　　从微生物组样品中集中培养感兴趣的细菌对于机理研究可能是至关重要的。不幸的是，当前缺乏以特定方式选择性培养大多数细菌物种的能力。因此，挑选大量菌落并依靠统计概率是当前获得感兴趣细菌的唯一可行的解决方案 。 然而，这种策略通常太消耗资源，因为它可能需要手动挑选数千个菌落 。 CAMII提供了一种ML引导的自动化菌落选择方法，该方法基于将分类学身份与菌落形态联系起来，因此在理论上可以增强靶向分离 。为了测试这一点，本研究系统地探索了深层肠道分离物的收集，以分析形态学和基因型数据之间的关系。有趣的是，不同属的菌落表现出不同的形态模式(图3)。例如，Dorea、拟杆菌和Collinsella的菌落通常大而密，但表现出不同的圆形(Collinsella >拟杆菌> Dorea)，这反映了它们生长特性的差异。另一方面，粪肠杆菌的菌落更小更模糊，与本研究早期的结果一致，它们的可培养性很差。此外，根据它们的系统发育，菌落形态显著聚类。例如，通过基于形态学的排序，大多数梭菌属彼此更接近。因此，菌落形态可能包含大量与分类身份相关的信息。
　　图3 使用菌落形态学预测分类学特性可增强靶向分离
　　细菌菌落可以通过物种间的相互作用影响其附近菌落的生长 ，例如竞争营养物或交叉喂养必需的代谢物。以前的研究表明，相邻细胞可以以可预测的方式严重影响菌落的大小 。因为CAMII可以连续跟踪菌落的动态生长，本研究系统地研究了琼脂平板上肠道分离物之间的共生长关联。粪便样本被铺板并成像，随后在第6天分离所有菌落，并用16S测序确定它们的分类身份(图4)。对于每个ASV，琼脂平板上菌落的累积面积与它们在原始粪便样品中的丰度相关，表明本研究的体外条件通常促进生长到与肠道中相同的程度。有趣的是，属于粪大肠杆菌属的菌落表现出较慢的初始生长，并且仅在附近有其他生长菌落存在时才开始出现。这一观察表明，粪肠杆菌和其他物种之间可能存在共生或互惠的相互作用。为了更系统地研究CAMII实现的物种相互作用，本研究分析了群体形态、分类同一性和群体邻域数据。本研究汇总了102071个视觉捕获的集落(26997个分离的)的形态学数据和物理坐标，并评估了集落的生长是否受到邻近细胞的影响。令人惊讶的是，本研究观察到一些有趣的共生长模式，可能反映了种间的相互作用。例如，创伤拟青霉ASV-6的菌落大小与相邻细胞的数量呈现负相关 ，这与创伤拟青霉和gut中的其他细菌之间存在由竞争或拮抗作用介导的一般负相互作用的情况一致。另一方面，粪大肠杆菌prausnitzii ASV-39与菌落动力学中较慢的初始生长相关的物种之一，它能够生长出较大的菌落，具有与相邻菌落的正相关性 。
　　图4 通过菌落形态分析肠道微生物群之间的相互作用
　　首先在本研究的分离物集合中探索人际菌株水平的基因组变异。与之前的报告一致，同一个体中的大多数分离株具有非常少的基因组变异(即少于102个SNPs)，而人与人之间的分离株存在103-105个全基因组SNPs的差异(图5)。有趣的是，观察到同一物种的一些系统发育不同的分离物(即超过104个SNPs)在同一个人体内共存 。 例如，从H4个体中分离出两种不同的P. vulgatus菌株，在H2个体中发现了两种不同的B. uniformis菌株。本研究接下来试图通过分析来自H1个体的408个分离的基因组来评估单个人内的菌株水平多样性。因为肠道中丰富的物种预计会经历更多的细胞分裂，本研究假设它们可能会在基因组中积累更多的SNP，假设肠道定植的持续时间大致相同。事实上，每个分类单元内全基因组SNPs的数量通常与其在原始微生物组中的丰度相关 。
　　图5 个体内和个体间肠道微生物群的菌株水平基因组多样性
　　2. 总结与展望
　　因为单个菌株是复杂群落中的行动单位，所以需要更完整的菌株收集。本研究提出的全面的生物库可用于重建一个更全面的背景，可以同时考虑到整个群落的组成、种间相互作用和代谢能力，这将改善微生物功能、动力学和稳定性的研究。除了人类肠道，CAMII还可用于其他微生物组，如来自土壤、水生或农业环境的微生物组，包括噬菌体、真菌和原生动物的进一步分离和分析。机器人自动化系统还可以帮助生成系统菌株库以及改进用于遗传工程的易处理微生物底盘的筛选 。
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