隐丹参酮体外抗病毒作用及机制研究

　　抗病毒天然免疫反应是宿主抵御病毒入侵的第一道防线［1］。病毒感染宿主细胞后，细胞内的模式识别受体（PRRs）通过识别病毒的病原相关分子模式（PAMPs），启动宿主抗病毒天然免疫应答以清除病毒，抵御病毒感染［2］。抗病毒天然免疫反应主要依赖4类PRRs对病毒DNA或RNA等PAMPs进行识别，包括识别RNA或DNA病毒的Toll样受体（TLRs）、识别RNA病毒的视黄酸（维甲酸）诱导基因蛋白I（RIG-I）样受体（RLRs）、识别RNA病毒的Nod样受体（NLRs）以及识别DNA病毒的受体如cGAS（cyclic GMP-AMP synthase）等［3］。
　　当PRRs与相应病毒的PAMPs结合后，会激活细胞内一系列信号级联反应，进而激活核转录因κB（NF-κB）、干扰素调节因子3（IRF3）和干扰素调节因子7（IRF7）等转录因子，启动下游Ⅰ型干扰素（IFN-Ⅰ）及炎性因子的表达［3］。其中，IFN-Ⅰ是发挥抗病毒效应的主要细胞因子，也是应用最为广泛的一类抗病毒药物。
　　IFN-Ⅰ抗病毒效应的发挥主要依赖于激活蛋白激酶（JAK）-信号转导子和转录激活子（STAT）信号通路。IFN-Ⅰ与细胞表面的IFN受体IFNAR1和IFNAR2结合后，激活蛋白激酶JAK1和酪氨酸激酶TYK2，受体IFNAR1和IFNAR2被这2种激酶磷酸化后募集STAT，从而激活STAT蛋白发生磷酸化，磷酸化后的STAT形成同源或异源二聚体后入核，诱导干扰素刺激基因（ISGs）的表达［1］。ISGs基因编码的蛋白具有多种抗病毒功能，包括抑制病毒的入侵、病毒核酸的复制、病毒蛋白的翻译和病毒粒子的释放等过程［4］。因此，正向调控IFN-Ⅰ信号通路，不仅能增加IFN-Ⅰ的表达，而且可以提高下游ISGs的表达，发挥对IFN-Ⅰ通路的级联放大效应。
　　丹参具有活血化瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈等功效，在抗炎［5］、抗肿瘤［6］、抗血栓［7］等方面有广泛的研究。隐丹参酮是从丹参中分离得到的1种主要的脂溶性化合物［8］，呈橙色针状结晶，在药理活性方面取得很多研究进展，包括抗炎［9-10］、抗肿瘤［11］、心脏保护、神经保护、血管保护及抗代谢紊乱等。另外，有研究证明隐丹参酮可以通过靶向STAT3减少猪肺泡巨噬细胞中IL-10及CD163的表达，抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒［12］。然而，隐丹参酮对于其他病毒的抗病毒效应及分子机制仍不明晰。本研究主要以IFN-Ⅰ通路为切入点，探讨隐丹参酮细胞水平的抗病毒效应，为隐丹参酮的抗病毒研究和应用提供科学依据。 隐丹参酮对A549细胞无毒浓度的确定
　　通过CCK-8法检测不同浓度的隐丹参酮处理24 h后对A549细胞存活率的影响，计算得到半数抑制浓度（IC50）为16.06 µmol·L-1（图1）。后续选取无明显细胞毒性的低、中、高浓度（2、4、8 µmol·L-1）进行实验。
　　隐丹参酮抑制病毒复制隐丹参酮对VSV病毒复制的影响
　　利用带GFP标签的VSV病毒感染A549细胞，通过流式细胞术及qRT-PCR技术，检测VSV病毒复制情况。流式结果表明，与对照组比较，病毒模型组GFP阳性细胞比率较高（ P  0.001）；与病毒模型组比较，隐丹参酮组GFP阳性细胞比率明显降低（ P  0.001），8 µmol·L-1隐丹参酮组抑制病毒复制效果显著（ P  0.001），结果见图2-A。qRT-PCR结果表明，与对照组比较，病毒模型组VSV病毒RNA丰度较高（ P  0.001）；与病毒模型组比较，隐丹参酮组显著抑制VSV病毒RNA丰度（ P  0.001），结果见图2-B。通过Western blotting实验检测隐丹参酮在蛋白水平对VSV病毒的影响，结果表明，与对照组比较，病毒模型组VSV病毒G蛋白大量表达，与病毒模型组比较，隐丹参酮组显著抑制VSV病毒G蛋白表达，结果见图2-C。
　　2.　隐丹参酮对EMCV、H1N1、HSV-1病毒复制的影响
　　为了探究隐丹参酮对不同病毒的抑制作用，利用EMCV、H1N1、HSV-1感染A549细胞，同时加入隐丹参酮处理通过qRT-PCR技术检测病毒基因拷贝情况，结果表明，与对照组比较，病毒模型组病毒基因的拷贝数均显著升高（ P  0.01、0.001）；与病毒模型组比较，隐丹参酮组病毒基因的拷贝数均显著降低（ P  0.05、0.01、0.001），说明隐丹参酮抑制EMCV、H1N1、HSV-1病毒的复制，结果见图3。
　　隐丹参酮作用于VSV-GFP病毒复制周期的多个阶段
　　为了探究隐丹参酮对VSV-GFP病毒复制周期不同阶段的影响，设置了不同的加药方式（图4-A），分别为吸附前预给药隐丹参酮、吸附2 h过程中给药隐丹参酮、吸附2 h后给药隐丹参酮、吸附2 h过程中及吸附2 h后给药隐丹参酮，通过流式细胞术检测不同药物处理方式下隐丹参酮对VSV-GFP病毒复制的影响。流式细胞术结果表明，吸附前预给药隐丹参酮处理方式下，与对照组比较，病毒模型组具有较高的GFP阳性细胞比率（ P  0.001）；与病毒模型组比较，隐丹参酮预给药组可以显著降低GFP阳性细胞比率（ P  0.001），表明隐丹参酮预给药可以抑制病毒复制，隐丹参酮在病毒进入前发挥作用（图4-B）。
　　吸附过程中给药隐丹参酮处理方式下，与对照组比较，病毒模型组具有较高的GFP阳性细胞比率（ P  0.001）；与病毒模型组比较，吸附过程中给药隐丹参酮组也具有较高的GFP阳性细胞比率，没有显著性变化，表明隐丹参酮对病毒吸附过程没有影响（图4-C）。吸附2 h后给药隐丹参酮、吸附2 h过程中及吸附2 h后给药隐丹参酮处理方式下，与对照组相比，病毒模型组具有较高的GFP阳性细胞比率（ P  0.001）；与病毒模型组比较，病毒吸附2 h后给药隐丹参酮组和病毒吸附2 h过程中及吸附2 h后给药隐丹参酮组GFP阳性细胞比率均显著降低（ P  0.05、0.01、0.001）见图4-D、E。以上结果共同表明，隐丹参酮预处理及吸附后给药可以显著抑制病毒复制，其对病毒的吸附过程无影响。
　　隐丹参酮调控先天免疫，激活IFN-I信号通路
　　1.　隐丹参酮对A549细胞基因的影响
　　利用RNA-Seq测序技术并结合生物信息学分析，进一步探究隐丹参酮处理引起的A549细胞中的基因变化。结果显示，与正常A549细胞（对照组）比较，8 µmol·L-1隐丹参酮处理24 h后A549细胞测序分析共富集到2 416个差异表达基因，其中上调基因有1 076个，下调基因有1 340个（图5-A）。对差异表达基因进行基因集富集分析（GSEA）分析发现，差异基因富集到与抗病毒天然免疫应答相关的Toll like receptor signaling related to MyD88、Jak-stat signaling pathway等信号通路（图5-B、C）。
　　2.　隐丹参酮对A549和PM细胞中IFN-I通路相关基因表达的影响
　　由于IFN-I及其下游靶基因的表达直接反映宿主细胞的抗病毒免疫状态。因此，利用qRT-PCR技术检测隐丹参酮处理的A549和PM细胞中IFN-I通路的相关基因表达变化。qRT-PCR结果显示，与对照组比较，隐丹参酮组可以诱导A549和PM细胞中 IFNB1 、 IFIT1 、 IFIT2 基因表达（ P  0.05、0.01、0.001），结果见图6-A、B。
　　poly（I C）是1种合成的双链RNA（dsRNA）类似物，可模拟RNA病毒感染。在A549细胞中转染poly（I C）5 h后，加入隐丹参酮处理12 h，qRT-PCR结果显示，与对照组比较，模型组高表达 IFNB1 、 IFIT1 、 IFIT2 （ P  0.001）；与模型组比较，隐丹参酮组进一步增强 IFNB1 、 IFIT1 、 IFIT2  mRNA表达（ P  0.01、0.001），尤其以促进 IFNB1 表达更明显，表明隐丹参酮以浓度相关方式促进poly（I C）对IFN-I通路的激活效应（图7）。以上结果表明，隐丹参酮处理可直接激活IFN-I信号通路。因此，推测这可能是其发挥抗病毒效应的机制之一。
　　隐丹参酮对Vero和Ifnar1-/-A549细胞中VSV-GFP病毒复制的影响
　　Vero细胞是一种天然的干扰素信号通路缺陷的细胞［14］。鉴于隐丹参酮单独加药后可以激活A549细胞与PM细胞内IFN-I信号通路，引起 IFNB1 、 IFIT1 、 IFIT2 基因上调。利用VSV-GFP感染Vero细胞，结合流式细胞术分析，发现与模型组相比，隐丹参酮组GFP阳性细胞比率稍有降低（ P  0.05），结果见图8-A。进一步利用本实验室构建的干扰素受体IFNAR1敲除A549细胞（ Ifnar1 -/-A549），探究隐丹参酮发挥抗病毒作用与IFN-I信号通路的关系。流式结果显示，野生型细胞（A549细胞）中，隐丹参酮加药后的GFP阳性细胞比率降至30%； Ifnar1 -/-A549细胞中隐丹参酮加药后的GFP阳性细胞比率下降至60%，隐丹参酮抗病毒功能被显著削弱，表明隐丹参酮的抗病毒功能在一定程度上依赖IFN-I信号通路（图8-B）。
　　讨论
　　丹参具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化等广泛的药理作用，临床上主要用于心血管疾病的治疗［15］。最新的研究表明，丹参通过对宿主免疫系统的整体调控，影响免疫细胞的发育、激活［16-17］，并发挥抗炎症性疾病、抗肿瘤的药理药效。此外，丹参提取物具有抗病毒作用［18-19］，其提取物可减少肠病毒71型（EV71）RNA合成，抑制由EV71所引起的细胞病变效应，从而改善由EV71所引起的细胞凋亡［19］；丹参在体内外均发挥有抗新型冠状病毒（SARS-Cov-2）的作用，在293T细胞中半数有效浓度（EC50）为0.31 µmol·L-1［18］。然而，隐丹参酮作为丹参中主要的脂溶性成分，其抗病毒功能与机制仍不甚明晰［20］，开展隐丹参酮的抗病毒研究对阐明丹参的抗病毒药理药效具有重要意义。
　　本研究利用流式细胞术、qRT-PCR等技术证明了隐丹参酮可在细胞水平抑制VSV、VSV-GFP、EMCV、H1N1、HSV-1病毒复制。通过在VSV-GFP病毒吸附前后的不同阶段加药处理，发现隐丹参酮预处理和在病毒进入后处理，其抗病毒效应最为明显。通过生物信息学分析结合qRT-PCR验证，发现在A549细胞和小鼠PM细胞中，隐丹参酮单独处理即可诱导 IFNB1 、 IFIT1 、 IFIT2 基因表达。提示隐丹参酮可以直接调控细胞内的IFN-I信号通路。此外，发现在Vero细胞中隐丹参酮的抗病毒功能受到抑制，在 Ifnar1 -/-A549细胞中隐丹参酮的抗病毒功能也被显著削弱。这些结果共同表明，隐丹参酮发挥抗病毒作用部分依赖干扰素信号通路。其激活IFN-I通路抗病毒的具体分子机制将是以后进一步研究的重点。
　　本研究表明隐丹参酮在细胞水平可以抑制VSV、VSV-GFP、EMCV、H1N1、HSV-1病毒复制，其抗病毒作用一定程度上依赖基于IFN-I通路的抗病毒天然免疫应答。揭示了隐丹参酮发挥抗病毒效应的部分分子机制，为丹参及隐丹参酮的抗病毒研究提供可靠的科学依据。
　　利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
　　参考文献（略）
　　来 源：成翠芹，马文福，李琪琪，孔令东，谢芳，贾 鑫，王遥．隐丹参酮体外抗病毒作用及机制研究 [J]. 药物评价研究, 2022, 45(9): 1706-1715 .