神奇的数字全息显微镜

　　作者：何炳恩 龚湘君
　　显微镜的出现，让人类观察世界的能力得到大幅提升，那些原本无法通过肉眼观察的微小物体从此清晰可见。数字全息显微镜则更进一步，突破传统显微镜的平面成像的限制，实现了物体的三维成像。
　　从光学显微镜到电子显微镜，人类观察微观世界的努力从未停下过脚步。光学显微技术作为一种快速无损的表征方法，可获得微米尺度观察对象的图像信息，应用范围极为广泛；电子显微镜则以高速运动的电子为介质，通过电子束＂看清＂更小的观测样品。但无论是光学显微镜还是电子显微镜，获得的都只是平面图像。数字全息显微镜是一种新型的光学三维成像途径。
　　光 的 干 涉
　　从火把到电灯，人类利用光的身影始终出现在文明的发展历程中。但对光本质的认识，却不那么一帆风顺。早在17世纪，牛顿便在其所著的《光学》中提出光是一种高速运动的微粒流，但这个说法并不能解释日常生活中所见的某些现象。在同一时期，荷兰物理学家惠更斯提出了光的波动说，但由于理论尚不完善及牛顿的影响力，该学说并未得到大众认可。
　　1801年，托马斯·杨做了著名的双缝干涉实验。他将一束单色光照射在两条平行且足够狭窄的细缝上，细缝后方的屏幕上显示出若干条明暗相间的条纹，这种现象即为干涉。光的波动说能较好地解释干涉现象。把光想象成水面上的波纹，它在向远处扩散的同时进行着上下往返的波动。从原理上分析得知，光照射在狭缝上，实际上形成了两束相干光，它们到屏幕上任意一点的距离并不相同，当这两束光在该点相遇时，它们的波峰和波谷位置并不一致。二者进行叠加，其波动的抵消与加强便形成了明暗条纹。日常生活中，干涉现象随处可见，如肥皂泡上五彩斑斓的条纹，正是光发生薄膜干涉的缘故。
　　波的加强与抵消
　　全息术的发展史
　　光是一种电磁波，它的传播有着一个往返振动的相位。但与能轻易观测的水面波纹不同，光的相位变化实在太快，达到1014赫量级，而常规的相机记录频率不过是数十到数百赫兹，根本来不及记录相位变化的过程。因此，通常只能获得光场振幅的平均值即光强，而无法获得其相位信息。
　　干涉条纹可以反映光的相位信息，根据干涉现象反向推算出光场相位信息的方法就是全息术。全息术译自英语holography，顾名思义，表示同时获得光的全部信息，包括光强及相位信息。它最早由英国伦敦帝国科技学院的匈牙利裔物理学家伽博（D. Gabor）在1947年提出 [1]。他发现在使用单色光照射物体时，可以利用干涉现象将光的相位信息保留在记录介质上，用相同的光照射记录介质时可以重新获得物体的光场信息。伽博使用化学胶片记录下了首张全息图并发展了全息摄影技术，由此获得1971年诺贝尔物理奖。
　　全息术在出现之初并不惹人注目，因为它在实际使用中效果并不理想。当时作为光源的汞灯相干性较差，超细微粒银盐全息干版需要长时间曝光才能记录全息信息，而后还需要在暗室进行显影、定影、漂白等一系列处理，才能获得一幅全息图像。进行全息记录需要极其稳定的条件，且时间和材料成本较高，这些缺陷限制了全息术的发展。
　　早期的全息术中，物光与参考光方向一致，这就是同轴全息。同轴全息获得的全息图在还原光场信息时会产生一个与物像重叠的共轭虚像，故在相位的还原上存在较大问题。为解决该问题，1962年，美国密歇根大学的利思（E. Leith）和乌帕特尼克斯（J. Upatnieks）提出离轴全息 [1]。他们将通信理论中的载频概念推广到空域中，实现了实像与共轭虚像之间的分离。离轴全息引入一个微小的倾角，令物光与参考光的传播方向不完全一致，形成的全息图在频谱中可以区分物像和共轭虚像，进而能以滤波的方式规避共轭虚像的叠加，解决了同轴全息方法中难以进行的相位计算问题，使得利用单张全息图像计算相位成为可能。
　　1960年代，激光发生器的出现为全息术提供了一种稳定且高度相干的光源，极大提高了全息精度的上限。另一方面，电子成像设备及计算机的发展为全息术的数字化创造了条件。1967年，古德曼（J. W. Goodman）和劳伦斯（R. W. Lawrence）使用由计算机控制的相机进行了全息图像的记录。他们以氦氖激光器为光源，用相机记录了一张256 256像素的八级灰度图，并使用计算机算法对获得的图像进行二维傅里叶变换操作。通过对比数字计算结果与纯光学方法图像，他们证实了使用相机和计算机进行数字记录及计算重建被记录对象的可行性，为之后数字全息计算的蓬勃发展打下坚实基础。
　　1994年，施纳斯（U. Schnars）和于普特纳（W. Jüptner）实现了全息术的全面数字化，全息术的研究由此进入新阶段。他们使用电荷耦合器件（charge-coupled device, CCD）相机对一颗骰子全息记录，并使用计算机算法进行数字重建，成功还原出骰子的光强图像。相比需要在暗室冲洗胶片的传统光学全息术，数字全息术在使用便捷性上拥有压倒性优势。
　　数字全息显微镜
　　数字全息显微镜（digital holographic microscope）是利用光的干涉现象提取样品三维信息的光学测量装置。它结合了光学显微成像及数字全息技术，把平面成像时失去的反映高度的相位信息保留在干涉条纹中，由相机对其进行记录，并通过后续计算模拟光在空间中的传播，重建包含目标在内的特定三维空间内的光场，从而实现对样品表面的准三维成像。数字全息显微镜在多年发展中逐渐拓展出多种应用，应用成熟度最高的有微粒三维运动的追踪和三维形貌的表征成像。
　　微粒追踪
　　同轴数字全息显微镜具有快速成像的优点，可追踪空间中微粒三维运动，这是传统全息技术难以实现的。它先通过样品微粒的散射光和周边空白区域发生干涉所形成环状的干涉条纹，得到全息图像；再根据光场的衍射理论，对全息图像进行数值重建计算，从而获得物光在三维空间分布。通过对聚焦位置的判定，同轴数字全息显微镜能极其准确地获得微粒样品在空间中的位置信息，其精度甚至能突破衍射极限的限制 [2]。
　　由于同轴数字全息显微镜在观测中，不需要进行染色等影响生物活性的制样过程，因而特别适用于研究微生物和颗粒在溶液及界面附近的运动行为。笔者课题组使用同轴数字全息显微镜对大肠杆菌的运动轨迹进行了追踪（细菌培养在一个逐渐降解的表面上），观测并获得大肠杆菌在该表面附近的运动方向、速度、趋势等参数，进而分析该类表面针对微生物的动态防污效果 [3]。此外，课题组还对电场中大肠杆菌的三维运动进行了监测。通过分析大肠杆菌在不同周期的电场中运动状态的差异，揭示大肠杆菌黏附行为与电场周期之间的联系，为利用电场进行废水处理和海洋防污提供了新思路 [4]。
　　大肠杆菌（左）和假单胞菌（右）在可生物降解的表面上的典型轨迹 [3]
　　除了能确定微粒位置，同轴数字全息显微镜还能还原微粒大小和形态，为进一步分析其表面的微观变化做好前期工作。2020年，斯奈德（K. Snyder）等人应用全息显微技术研究抗体与抗原的结合 [5]。他们在聚苯乙烯微球表面修饰上抗原蛋白，并将微球分别加入两种不同抗体的溶液中，基于洛仑兹—米氏（Lorenz-Mie）光散射理论对全息图像进行拟合计算，获得微球直径的变化情况，进而推断抗体在小球表面的覆盖情况，为抗体浓度、微观结合机理等方面的分析提供参考依据 [5]。
　　基于全息粒子标准的分子结合示意图 [5]
　　分子尺度的抗体涂层影响珠子的全息图记录（左）与拟合洛仑兹—米氏光散射理论的预测来量化抗原—抗体结合的影响（右）[5]
　　形貌表征
　　传统的光学显微镜仅仅能平面成像，无法获得高度信息，而数字全息显微镜却能通过对光场信息的还原计算出光程差，进而获得样品的三维形貌。最早，全息术仅能对光强进行一定的还原而无法获得三维形貌，原因是存在共轭虚像的干扰。为解决此干扰问题，不同的光学设计方式被提出并各自发展壮大。
　　最容易实现的是上文提到的利思等人提出的离轴全息方法。随着频域滤波等算法及硬件条件的提升，离轴数字全息显微镜的空间精度有大幅提升，已达到纳米级。2008年，瑞士一课题组使用离轴数字全息显微镜对在石英基片上用铬蒸镀的微台阶表面形貌(高约8.9 纳米)进行了三维测量，实现了高精度的三维形貌观测 [6]。他们分别使用波长分别为657纳米和680纳米的两种光源进行观测，发现二者在还原结果上差距较小，且计算获得的横截面高度与其他仪器标准获得标准值的差距在误差范围内。
　　由于离轴数字全息显微镜能够对样品的动态过程进行三维无损观测，故适合用于细胞相关的生物样品研究，如拉帕兹（B. Rappaz）等人使用离轴数字全息显微镜对野生型及突变型酵母细胞的分裂周期进行了成功观测 [7]。此外，还有研究者利用它对阿米巴变形虫、海拉细胞、人体红细胞等多种样品进行了三维成像及研究。综上，离轴数字全息显微镜由于能复原物体或表面精细的相位形貌，可广泛应用于生物细胞的检测领域。
　　除离轴全息外，研究人员还提出了相移全息。1969年，克兰（R. Crane）首次明确提出相移干涉测量的概念。相移数字全息显微镜是一种结合全息显微及相移干涉技术的装置，通过多幅携带一定相移量的干涉图像获取待测物光波前的相位分布。使用时，先通过对参考光调制，改变相干光之间的相位差，获得一系列全息图像。之后，通过对这些全息图像进行计算，获得物光的相位信息，进而获得样品表面的三维形貌。
　　由于相移数字全息显微镜获得三维形貌得基于多张全息图像，因此需要对静止样品多次成像或使用多台相机对同一样品成像。前者是较常见的做法，使用的是时间相移数字全息显微镜，先在相位差随时间进行移动的情况下用一台相机进行成像，不同时间的图像组成一组相移全息图像，进而计算出样品三维图像。这一类装置光路相对简单，相移控制也较灵活，因此在研究使用上相对广泛。但由于时间相移数字全息显微镜要求相移前后样品不变，故只适用于静止或准静止样品，如电子元器件等。对于动态变化过程，有人研制出空间相移数字全息显微镜，使用多台相机或同一相机的不同位置进行记录，以获得同一时间下样品在不同相移量下的全息图像。这种装置能实现动态观测，但对光路设计和硬件配置的要求很高。2004年，日本科学家粟辻安浩（Y. Awatsuji）等人通过掩膜板技术在相机前加入了相移阵列，使得同一相机上各部位的相移量不同，实现了多幅相移全息图像的同时记录 [8]。
　　通过光源的调制，也能实现相位的获取。2019年，张贺等人发表的关于近场傅里叶叠层成像研究的论文 [9]，讲述他们用散斑照明代替原本均匀的光照，通过散斑与样品之间的相对运动实现干涉状态的变化，进而利用多幅低分辨图像计算出样品的光强及相位信息，并较大幅度提升了所获图像的分辨率。
　　除去成像光路上的修改，开发算法推算同轴全息中光场的相位信息也是研究重点。早在1970年代，英国剑桥大学的格奇伯格（R. W. Gerchberg）和萨克斯顿（W. O. Saxton）就提出格奇伯格—萨克斯顿（Gerchberg-Saxton）算法（简称GS算法）来恢复成像过程中丢失的相位信息。其他研究人员在此基础上，发展出Fienup法等改良方法。这类方法与之前提及的直接计算的全息术不同，是通过代入估计值进行迭代逼近真实值来获取相位信息，对计算机算力、图片质量等要求较高。
　　近年来，随着相机成像精度和计算机算法及运行速度等多方面的提升，结构简单稳定性高的同轴全息再次受到重视。如美国加利福尼亚大学研究组在同轴全息显微镜的基础上引入发光二极管（light-emitting diode, LED）阵列，在不加入透镜的情况下，通过计算机算法实现了超分辨率成像 [10]。他们使用该装置对感染了疟疾寄生虫（恶性疟原虫）的红细胞进行成像，寄生虫在无透镜显微镜的振幅和相位图像中均清晰可见。
　　无透镜超分辨率全息显微镜对感染了疟疾寄生虫（恶性疟原虫）的红细胞成像获得的振幅及相位图（左）与在40倍光学显微镜下获得的图像（右）对比 [10]
　　未 来 展 望
　　数字全息显微镜作为一种快速定量三维成像方法，使我们在不需要对样品进行过多处理的情况下，实现对微粒的实时三维观测，获取其空间三维信息随时间的变化过程。目前，它已广泛应用在微粒表征、生物样品检测等科研领域。
　　尽管全息术仍受到相机分辨率、激光散斑等因素影响，但随着光路的创新与优化、算力的提升、图像处理和深度学习算法等蓬勃发展、激光调制技术的改良，以及相机在精度及采集速度上的突破，相信在不久的将来，这项技术将会更加完善。它与其他技术相结合，会在微观领域的研究与检测中绽放独特光彩，成为促进科学研究的利器。
　　何炳恩，博士研究生；龚湘君，教授：华南理工大学材料科学与工程学院，广州 510641。msxjgong@scut.edu.cn
　　He Bing’en, Doctoral Candidate; Gong Xiangjun, Professor: School of Materials Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510641.
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　　[8] Awatsuji Y, Sasada M, Kubota T. Parallel quasi-phase-shifting digital holography. Applied Physics Letters, 2004, 85(6): 1069-1071.
　　[9] Zhang H, Jiang S, Liao J, et al. Near-field Fourier ptychography: super-resolution phase retrieval via speckle illumination. Optics Express, 2019, 27(5): 1498-7512.
　　[10] Bishara W, Sikora U, Mudanyali O, et al. Holographic pixel super-resolution in portable lensless on-chip microscopy using a fiber-optic array. Lab Chip, 2011, 11(7): 1276-1279.
　　关键词：数字全息 三维追踪及成像 计算成像