原代T细胞难转染？那是工具没选对

　　T 细胞 (T cell 、 T 淋巴细胞 /T lymphocyte) 是淋巴细胞的一种，在免疫反应中扮演着重要的角色。 T 细胞在胸腺内分化成熟，成熟后移居于周围淋巴组织中。随着细胞免疫治疗的日益深入， T 细胞的基因工程化改造显得越来越重要。
　　然而， T 细胞的基因操作却异常困难，普通的 DNA 质粒根本就转不进去，即使是病毒介导的基因转染操作，也有不少难题，主要体现在几个方面 :
　　1  常规的慢病毒，由于
　　T细胞膜上受体的不稳定；
　　非激活的 T 细胞本身无增殖能力；
　　T细胞内部有阻碍反转录的机制等原因而导致慢病毒的T细胞感染能力 偏弱，需要多次重复感染，且对于实验操作的条件要求十分苛刻
　　2体外培养的 T 细胞本身十分敏感且脆弱，慢病毒感染对细胞的状态影响非常大
　　3T 细胞是悬浮细胞，进一步增大了病毒感染的难度
　　遇上这样＂ 磨人的细胞 ＂怎么办？
　　汉恒病毒载体工程师们深切体会到了大家的痛苦
　　通过多次实验， 研发出适用于  原代T细胞基因操作的悬浮细胞专用的腺病毒（Ads）和慢病毒（hTLv）。 其中Ads也非常适用感染其他悬浮细胞，如Jurkat，K562，HL-60和L1210等。慢病毒hTLv适用人原代T细胞的感染还可以用来构建稳转系。
　　感染效果图
　　汉恒原代T细胞感染实例——使用悬浮细胞专用腺病毒ads感染
　　悬浮细胞专用腺病毒Ads感染小鼠原代CD4+ T细胞
　　细胞：小鼠原代CD4+ T细胞
　　刺激方式：CD3/CD28抗体和IL-2激活48h
　　病毒：Ads-GFP, 1 10^10 PFU/ml
　　使用方式：MOI=500
　　悬浮细胞专用腺病毒Ads感染人原代CD4+ T细胞
　　细胞：人原代CD4+ T细胞
　　刺激方式：CD3/CD28抗体和IL-2激活48h
　　病毒：Ads-GFP， 1 10^10 PFU/ml
　　使用方式：MOI=100
　　汉恒原代T细胞感染实例——使用慢病毒
　　原代T细胞专用病毒-慢病毒感染人原代CD4+ T细胞
　　细胞：人原代CD4+ T细胞
　　刺激方式：CD3/CD28抗体和IL-2激活48h
　　病毒：hTLv-GFP，1*10^8 TU/ml
　　使用方式：MOI=50
　　上文我们了解到T细胞是很难被感染的，除了使用正确的病毒工具外，在细胞制备后想要成功感染T细胞还有两个关键步骤： 细胞体外刺激、细胞感染
　　细胞体外刺激
　　1 .  按照小鼠或人源  CD4+T   细胞分离  kit (Thermo)  说明书分离得到  CD4 +T   细胞。
　　2 .  取所需体积的  PBS ，按照  5  μg/ml   的终浓度加入  Anti-mouse CD3e  和  Anti-mouse CD28  抗体， 500 μl/ 孔包被  Non-Treated 24-well plate ，室温放置  4 h ，吸掉抗体悬液，加入  500 μl 1% BSA （ PBS  配置）室温封闭  30 min ，封闭结束加入  500 μl PBS  洗孔一次。
　　注： 请在分离细胞的同时准备好平板，包括后续感染所需的量。
　　3 ．将分离得到的  CD4+ T  按照浓度  5x105 cell/ml  重悬在完全  T  细胞培养基中（ 1640 ， 10% FBS ， 1% penicillin-streptomycin ，  50 μM β-mercaptoethanol, 100 U/ml IL-2 ），将细胞加入步骤  2  中包被处理好的平板， 2 ml  每孔（ 1x106 cell/well ），然后放入  37    CO2 培养箱刺激培养  48 h 。细胞在刺激  24 h  后体积略微增大，进入活化状态，刺激  48 h  后可进行病毒感染。
　　细胞感染
　　1.  收集活化好的  CD4 +T   细胞， 400 g  离心  5 min 。用  T  细胞培养基重悬计数备用，在收集的过程中发现有些细胞会贴壁，此为正常现象，可反复吹打至贴壁的细胞也呈悬浮状态。
　　2.   另取一  Anti-mouse CD3e  和  Anti-mouse CD28  抗体包被好的  24  孔板，每孔加入  2-5x105  的细胞（若为  96  孔板，加入  2x104  细胞 / 孔）。若考虑长期表达目的基因，按  MOI=50-100  加入汉恒生物  T  细胞专用慢病毒  hTLv-GFP， 注意鼠源和人源原代  T  细胞所适合的慢病毒种类差别；若考虑瞬时（一周以内）表达目的基因，可按  MOI=500-1000  加入汉恒悬浮细胞专用腺病毒  Ads-GFP 。同时加入  polybrene  至终浓度  6 g/ml ，最终感染体积为  500 μl ，加入病毒后轻轻吹打混匀。
　　注： 具体 MOI 选择可在 96 孔板中预实验进行梯度摸索，对于慢病毒建议使用 10，30，100 的梯度进行，对于腺病毒建议使用 500，1000，1500 的梯度进行摸索。
　　3.  24-wellplate  于  1000 g  室温离心感染  90 min 。离心结束后将平板放入  37    CO2  培养箱感染  6 h 。
　　注： 离心结束观察细胞 分散状态， 除非细胞全聚集在一处，否则不建议吹散细胞。
　　4.  感染结束后取出培养板，小心吸掉感染孔中  350 μl  的培养基（ 70% ），加入  1.85 ml  的  T  细胞完全培养基补足体积为  2 ml  并吹打混匀。
　　5.  可选步骤：病毒感染  24 h  后，小心吸掉培养基，在同一培养皿中按照  2-4  步进行病毒复感染操作。
　　6.   将细胞放入  37    CO2  培养箱继续培养， 2   3  天后可观察荧光，做流式检测感染效率。正常情况下，汉恒生物提供的  T  细胞专用慢病毒（h T Lv  ）和悬浮细胞专用腺病毒（ Ads ）感染原代  T  细胞的效率大于  50% 。