感染全球土壤环境的，芽孢杆菌噬菌体，是如何进行传播和进化的？

　　文|小张
　　编辑|小张前言
　　噬菌体被广泛认为是高度丰富和遗传多样的，它们在许多病原体的进化和毒力中的作用，变得越来越清楚。
　　很少有人关注，捕食芽孢杆菌的噬菌体，尽管它的一些成员（例如炭疽芽孢杆菌）有可能导致严重的人类疾病
　　噬菌体（或噬菌体）是被认为是自然界中，最丰富的生物实体的细菌病毒，据估计，地球上任何时候都存在 10 31个噬菌体颗粒。
　　噬菌体选择性地靶向并感染它们的细菌宿主，并劫持细胞机器，最终导致宿主裂解。
　　它们被认为与维持混合群落的生态平衡有关，并且可以通过与其宿主的直接相互作用，影响微生物平衡。
　　芽孢杆菌是什么？
　　芽孢杆菌是土壤环境中常见的形成孢子的革兰氏阳性细菌。该属中的两个物种蜡样芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌，以其分别引起人类食源性疾病，和炭疽的能力而闻名 。
　　B. anthracis感染对暴露的人类造成严重疾病，或死亡的高风险，并且被认为是国家安全风险，因为之前已经报道过使用B. anthracis孢子，进行生物恐怖主义袭击。
　　由于炭疽杆菌的致病性，及其在生物恐怖主义中的潜在用途，快速检测活细菌及其孢子至关重要。
　　炭疽芽孢杆菌的过时检测方法，包括培养生物体，然后将其与其他芽孢杆菌属物种区分开来，这需要使用分子技术，这可能需要几天时间 。
　　检测活炭疽杆菌细胞的一种有吸引力的方法，是使用专门针对其宿主的噬菌体。事实上，利用炭疽芽孢杆菌γ 噬菌体的测定。
　　由于使用方便且成本低廉，现已成为世界各地实验室，广泛使用的检测炭疽芽孢杆菌的诊断测试 。
　　杆菌属γ 噬菌体于 1950 年代首次被发现，并被证明对炭疽芽孢杆菌的，有荚膜和无荚膜变体 ，具有高度特异性，这是其作为诊断药物成功背后的主要驱动力工具。
　　芽孢杆菌γ 噬菌体家族，也构成了一些新一代潜在诊断学的基础，例如用于炭疽杆菌生物发光检测的噬菌体工程。
　　自引入下一代测序以来，大量可用的噬菌体序列数据，揭示了巨大的噬菌体遗传多样性。
　　鉴于针对模型宿主识别出大量噬菌体，理解和解决这种多样性是一项复杂的任务。
　　感染单个宿主的一些研究，最充分的噬菌体是那些感染耻垢分枝杆菌MC2155的噬菌体，已分离出近 12,000 个噬菌体，并对 2000 多个噬菌体进行了测序。
　　不同的噬菌体
　　根据它们的基因组序列，噬菌体被分为不同的组和簇 。同样，93芽孢杆菌的生物信息学分析噬菌体，导致噬菌体分为 12 个不同的簇，其中有 14 个单独的噬菌体。
　　这些单噬菌体之一是炭疽杆菌噬菌体 Tsamsa，这是一种大型 (169 kb) 温带噬菌体，具有 siphovirus 形态，10 多年前在纳米比亚分离出来。
　　从那时起，已报道了多种噬菌体，它们与 Tsamsa 噬菌体具有相似的基因组特征。
　　在这项研究中，从澳大利亚土壤样本中，分离出五种感染炭疽杆菌的新型噬菌体 。噬菌体基因组被测序并显示与 Tsamsa 噬菌体相关。
　　对公开可用的噬菌体分离序列，和宏基因组序列的筛选，揭示了另外 20 个分布在全球的噬菌体。
　　它们与 Thrax1-5 和 Tsamsa 噬菌体 ，具有相似的基因组特征。使用全面的生物信息学方法，我们确定这些噬菌体属于我们称为 Tyrovirus 组的新组。
　　此外，我们分析了酪氨酸病毒的形态学和基因组特征，并探索了它们与芽孢杆菌相互作用的本质。
　　这项研究最终扩展了一个噬菌体家族，它曾经是一个单一的，现在包括一个新组 Tyrovirus 下的另外 25 个噬菌体，并提供更多的基因组见解和对其进化多样性的理解。
　　五种炭疽杆菌噬菌体的分离
　　五种温带噬菌体 Thrax1-5 于 2016 年从澳大利亚北领地收集的土壤中分离出来。这些噬菌体是在无毒的炭疽芽孢杆菌菌株 Sterne (34F2)  上分离出来的，该菌株缺乏 pXO2 质粒和产生 poly-γ 的能力-d-谷氨酸胶囊。
　　鉴于这种胶囊的存在已被证明，可以防止一些炭疽芽孢杆菌噬菌体的感染 ，Thrax1-5 噬菌体的裂解能力，也在 9 种有胶囊的（有毒的）炭疽芽孢杆菌菌株上进行了测试。
　　Thrax1 噬菌体在所有九种菌株上引起宿主裂解，而 Thrax2、Thrax3 和 Thrax5 噬菌体分别仅在六种、两种和四种菌株中产生裂解。
　　噬菌体病毒粒子用乙酸双氧铀负染色，并在透射电子显微镜下成像，显示典型的管状病毒形态，具有直径约 78   3 nm  的等距二十面体头，和长度约 431   28 nm  的长非收缩尾。
　　我们检查了类似于 Thrax1-5 噬菌体的已测序基因组的公共序列数据库。相关的培养噬菌体包括 Tsamsa、Nate、Chewbecca、Skywalker、MrDarsey 和 Sophrita 噬菌体。
　　从炭疽芽孢杆菌、PBC2 、pW2 、Izhevsk和从蜡状芽孢杆菌、 Diildio分离的 Kirov 噬菌体在B. thuringiensis上分离的噬菌体，在B. subtilis上分离的FADO 和 PJN02 噬菌体，以及在B. cohnii上分离的噬菌体 136 。
　　随后使用 IMG/VR 对来自宏基因组数据集的，未培养病毒基因组组装进行调查，确定了另外七个与上述培养的，噬菌体基因组相似的独特噬菌体基因组，我们将其称为 Tyro1-7 噬菌体。
　　这些噬菌体基因组主要是从墨西哥和美国的土壤，和植物相关微生物组分析中发现的 。
　　用噬菌体样品进行分析
　　使用 VIRIDIC对这 26 种＂Thrax 样＂噬菌体进行的分析显示，根据核苷酸相似性分为 11 个属簇。
　　基因组间相似性范围从高达 94.9%，略低于种内边界（  95%）到低至 15.7%，尽管所有＂Thrax 样＂噬菌体共享等效物基因组大小和非常相似的基因组结构。
　　聚类被发现独立于隔离的地理，相反，聚类显示出与宿主物种相关的趋势（即分别从中国和葡萄牙分离的枯草芽孢杆菌噬菌体 PJN02 和 FADO，形成一个属簇）。
　　为了在系统发育上，对这组噬菌体进行定位和分类，我们使用了两种不同的病毒分类方法，即 vContact2 和 VICTOR。vContact2 ，是一种基于网络的策略。
　　可根据噬菌体基因组之间的，基因共享程度计算病毒簇。
　　对于此分析，除了上述 26 个 Thrax 样噬菌体基因组之外，我们还输入了截至 2022 年 4 月 GenBank 数据库中，存在的所有完整噬菌体基因组序列。
　　在由此产生的网络中，Thrax 样噬菌体紧密聚集在一起，靠近感染芽孢杆菌的其他培养噬菌体和相关属。
　　提取代表类 Thrax 噬菌体和邻近噬菌体的节点，并使用边缘加权弹簧布局进行可视化，以更好地观察分组特征。
　　Thrax 样噬菌体与最近的噬菌体邻居，紧密聚集在一起，这些噬菌体被鉴定为Geobacillus噬菌体 E3 ，和Brevibacillus噬菌体 Sundance 等。
　　我们将这 26 种紧密聚集的 Thrax 样噬菌体 命名为 Tyrovirus 组，该组因三种酪氨酸重组酶的保守性而得名。
　　酪氨酸病毒分组为一个排他性 VC，该 VC 进一步定义为 16 个子 VC，其中最大的子 VC 包括 Tsamsa、Izhevsk、Diildio 和 Thrax4 噬菌体。
　　噬菌体之间的进化关系
　　VICTOR 依靠全基因组系统发育来确定，噬菌体之间的进化关系 。在这里，输入包括酪氨酸病毒和 25 种相关噬菌体的总蛋白质序列（以 < 95% 的核苷酸同一性进行去重）。
　　VICTOR 系统发育与 OPTSIL 分类单元边界预测相结合，表明酪氨酸病毒形成属级进化枝，这一预测比 VIRIDIC 和 vContact2， 建议的预测更具侵略性。
　　许多这些噬菌体之间的核苷酸相似性，低于国际病毒分类委员会 ICTV ，为属级分组推荐的约 70% 阈值。
　　虽然 VICTOR 利用优化的基因组，爆炸距离系统发育 (GBDP) 来推断系统发育树，并且已经针对 ICTV 认可的大型参考噬菌体，基因组数据库进行了优化。
　　鉴于这些分析之间的不一致，我们不愿建议对实验室分离的Tyroviruses ，进行任何属级分类。
　　在这里，我们只是继续将它们和其他宏基因组，衍生的噬菌体称为酪氨酸病毒。
　　当扩展到亚科预测时，OPTSIL 将酪氨酸病毒与乳球菌av949 样噬菌体、短芽孢杆菌Sundance 噬菌体、芽孢杆菌SPbeta 样噬菌体和地芽孢杆菌E3 噬菌体分组。
　　它们通过 vContact2 衍生的网络系统发育相似地共同位于簇中。
　　仅根据经验确定了，单个酪氨酸病毒的精确基因组末端。Tsamsa 噬菌体显示含有 284 bp 的短直接末端重复序列 (DTR)。
　　为了确定 Thrax1-5 噬菌体的基因组末端，我们使用了 PhageTerm ，并结合对原始测序读数的手动检查。
　　与在 Tsamsa 噬菌体中看到的类似，发现噬菌体 Thrax1-3 含有 285 bp DTR，而噬菌体 Thrax4-5 含有 284 bp DTR。
　　短 DTR 的存在表明这些噬菌体，经历了 T7 噬菌体样 DNA 包装过程，其中用于包装的体内 DNA 底物是噬菌体 DNA 的串联体。
　　我们根据在 Tsamsa 噬菌体和 Thrax1-5 噬菌体中，观察到的 DTR 的序列同一性，继续鉴定其他分离的，酪氨酸病毒噬菌体的基因组末端。
　　噬菌体被预测包含与上述经验证实的 ，DTR 一致的序列， 并显示出一些高度序列同一性的区域。由于与上述噬菌体共享的核苷酸相似性较低，我们无法确认136、PJN02 和 FADO 噬菌体 中，是否存在 DTR。
　　使用噬菌体末端酶的序列同一性作为确定基因组包装策略的代理，我们将这三种噬菌体中存在的终止酶与 GenBank 非冗余蛋白质数据库进行了比较。
　　观察到存在于彼此基因组、其他酪病毒基因组和短芽孢杆菌噬菌体 Sundance 的末端酶的序列相似性最高。
　　Sundance 噬菌体的包装策略涉及短 DTR (323 bp) ，结合起来 136、PJN02 和 FADO 噬菌体也使用短 DTR。
　　模块化结构
　　Thrax1-5 噬菌体具有 157-169 kb 的大型线性基因组，编码 233-268 个 ORF，其中约 70% 编码假设蛋白，以及 6-22 个 tRNA。
　　基因组特征性地组织成功能模块，其中两个更突出的模块编码，参与病毒粒子形态发生和裂解，以及复制和核苷酸的基因代谢。
　　病毒体形态发生和裂解
　　左臂包含 32 个（Thrax1-3）或 34 个（Thrax4-5）正向转录基因，其中大部分参与宿主细胞裂解产生、包装和释放噬菌体子代颗粒。
　　DNA 包装模块由臂中的前两个基因组成，在 Thrax1-5 中非常保守（分别编码末端酶小亚基和大亚基）。
　　末端酶对于将噬菌体 DNA ，包装到噬菌体头部是必不可少的。作为一种酶复合物，小亚基决定了 DNA 结合的特异性，而大亚基介导噬菌体 DNA 的切割和包装 。
　　通过 NCBI 保守域数据库 (CDD)，这两个基因都缺乏可识别的保守功能域。
　　小亚基的预测基于它的基因组位置、轮廓隐马尔可夫模型 (HMM) 与已知 DNA 的相似性限制性核酸内切酶，和 DNA 结合蛋白，与大肠杆菌T4 噬菌体末端酶小亚基中 ，显示的 DNA 结合功能一致。
　　在其他酪氨酸病毒组噬菌体之外的，大亚基与乳球菌的末端酶。大亚基具有最高的相似性GenBank 上的 av949 样噬菌体，和轮廓 HMM 与 T4 噬菌体中末端酶大亚基的相似性。
　　我们已经分离出，五种感染炭疽病原体炭疽杆菌的噬菌体。
　　使用现代系统发育方法，我们将这五种新的芽孢杆菌噬菌体，以及从公开可用的数据库和宏基因组数据集中，检索到的 21 个相似的噬菌体基因组。
　　归入 Tyrovirus 组，这是一个新提出的组，由于三种不同的酪氨酸重组酶的保护而得名。
　　笔者观点
　　我认为 这些大噬菌体 (~ 160–170 kb) 的基因组分析揭示了它们的 DNA 包装机制和基因组特征，这些特征有助于病毒体形态发生、宿主细胞裂解和噬菌体 DNA 复制过程。
　　对三种酪氨酸重组酶的分析表明，酪氨酸病毒经历了一个，涉及宿主整合和质粒阶段的噬菌体生命周期。
　　此外，我们还表明 Tyroviruses 依赖于不同的入侵机制，其中一个子集需要宿主 S 层才能感染。
　　最终，我们扩展了对捕食关键相关芽孢杆菌属物种的，新的大量噬菌体群的分类、系统发育和基因组组织的理解。
　　在一个以噬菌体基因组学快速发展为特征的时代，未来酪氨酸病毒的沉积将进一步揭示这些芽孢杆菌噬菌体的全球传播和进化历史。
　　参考文献