天然中长肽十五肽的全合成及其膜活性的化学特征研究

　　文丨异文录
　　编辑丨异文录
　　摘要
　　哌珀霉素是天然存在的抗微生物肽，具有明确的螺旋构象和抗蛋白水解性。 这两个特征都源于在它们的序列中存在几个Cα-四取代的α-氨基异丁酸(Aib)残基。哌珀霉素与生物膜相互作用，通常导致其泄漏。
　　目前提出的所有肽-膜相互作用机制都是从肽聚集或积累开始的。最常被研究的肽链长的阿拉霉素通过在膜上形成小孔来发挥作用。相反，地毯机制已被用于短肽链。中等长度肽段的机理研究得很少，这部分是由于它们合成的困难。
　　据说，根据膜的性质，它们以不同的方式干扰膜的渗透性。目前的工作集中在最近发现的一种中等长度的肽链。与它的大多数家族成员相反，它的序列不包含羟脯氨酸或脯氨酸，并且它的螺旋不扭结。描述了一种可靠有效的合成方法，使我们也能生产两种较短的类似物。
　　通过多种技术的结合，我们能够建立一种三维结构与活动的关系。特别是，五溴二苯醚的膜活性在很大程度上取决于三个连续的Aib残基的存在，这三个残基负责其螺旋的清晰但适度的两亲性特征。最短的类似物，没有这三个Aib残基中的两个，保留了明确的螺旋构象，但没有其两亲性，并且几乎完全丧失了引起膜渗漏的能力。 我们得出结论，五溴二苯醚的两亲性可能是肽干扰模型膜的能力所必需的。 导言
　　哌珀霉素是一个天然抗微生物肽家族，其特征在于序列中有几个α-氨基异丁酸残基和一个C-末端1，2-氨基醇，因此得名。肽醇是抗蛋白水解和膜活性。它们有效地与磷脂膜相互作用，通过尚未完全了解的机制导致其渗漏，尽管已经观察到两种一般机制：地毯机制，典型地被短长度(大约10个残基)肽段所采用，例如trichogin GA IV，和桶形破碎机制，用长长度(约20个残基)肽段，如阿拉霉素。
　　中等长度的哌珀霉素，通常由13-15个氨基酸残基组成，是研究最少的。它们应该根据膜的组成和厚度在上述两种肽-膜相互作用机制之间转换。它们在机制之间的摇摆表明了一种选择性生物活性，这对于它们作为抗微生物剂或抗肿瘤剂的应用是有希望的。事实上，据报道，一些中等长度的肽段具有抗肿瘤活性。
　　与模拟健康细胞/红细胞的两性离子脂质体相比，中等长度的七肽也显示出对负电荷脂质体(癌细胞膜的简单模型)的选择性。由于缺乏有效的合成方法，对这类有前途的天然生物活性肽的进一步研究受到了阻碍，因为几个Aib残基的连续存在经常导致偶联失败和缺失序列的产生。
　　在这项工作中，我们重点研究了最近发现的中等长度哌珀霉素和十五卡宾。我们研究了三个连续Aib的伸展，这是中等长度哌珀霉素的一个共同特征，如何影响肽的三维结构和膜相互作用。我们还提出了一个简单的合成方法。报道的模型脂质体研究指出–( Aib)3–拉伸是成功的十五卡因介导的膜渗漏所必需的。
　　材料和方法
　　材料
　　磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和胆固醇购自Polar Lipids 。氯甲酸芴甲酯保护的氨基酸、TFFH和用于肽合成的溶剂购自适马-奥尔德里奇公司。Oxyma-pure和二异丙基碳二亚胺(DIC)购自IRIS Biotech。除非另有说明，所有其他试剂均购自Merck。
　　肽的合成和纯化
　　通过手动固相合成来合成肽，从2-氯三苯甲基树脂开始，预载有l-苯丙氨酸醇(加载量:0.4毫摩尔/克)和使用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)作为溶剂。不涉及Aib残基(Gly)的单一偶联步骤，用3当量引入的活化氨基酸残基进行。乙酰化两次[乙酸酐和二异丙基乙胺(DIPEA)在DMF中2 1，每次45分钟]。
　　然后在二氯甲烷(DCM)中干燥树脂，使用50%三氟乙酸(TFA)、47.5% DCM和2.5% TIS作为切割混合物重复肽切割两次(1 h + 1 h)，以完全去除Gln侧链的三苯甲基保护。从树脂上切下后，将粗肽从乙醚中倒出两次。使用反相C18柱，在Biotage Isolera Prime仪器上通过中压色谱纯化粗肽，获得的纯度> 92%。合成肽的高效液相色谱(HPLC)色谱图和电子喷雾电离高分辨率质谱(ESI-HRMS)光谱在中报告支持信息。ESI-HRMS在Waters Micromass Xevo仪器上进行。
　　圆二色性(CD)测量
　　CD测量在Jasco J-1500分光光度计上进行，使用1mm光程石英池。甲醇或100 mM十二烷基硫酸钠(SDS)在milliQ纯水机中的溶液用作溶剂。测量在25 下进行，采集16次扫描。
　　核磁共振分析
　　使用Bruker AVANCE DRX-400仪器在300或297 K下进行核磁共振(NMR)实验，操作频率为400 MHz1H.CD中的肽浓度为10 mM3哦，对了11,12]五溴二苯醚或30毫米SDS-d中的五溴二苯醚为1毫米12在H2O/D2O 9:1 + 1 μL HCl 3 mM溶于H2O.使用程序TopSpin和Sparky对实验数据进行处理和评估。
　　CLEAN-TOCSY(旋转锁定期，70毫秒)，ROESY(用于[desAib11,12]五溴二苯醚；自旋锁周期，100毫秒)和NOESY(混合时间，250毫秒)光谱以相敏模式记录。CD的-OH信号和H2o被水门梯度序列所抑制。所有同核2D谱都是通过收集512个实验获得的，每个实验48-128次扫描，弛豫延迟为1-1.2秒，数据点为2-K。每个维度的光谱宽度为10 ppm。
　　泄漏实验
　　磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺购自两代情极性脂质公司，而胆固醇是Merck的产品。将每种脂质混合物溶解在CHCl3中在试管中，在氮气下干燥2室温下，用5(6)-羧基荧光素(CF)在30-mM HEPES缓冲液(pH 7.4)中的溶液重构所得脂质膜1小时。所得多层囊泡悬浮液在冰上超声处理(GEX 400超声波处理器，适马奥尔德里奇)两次。
　　通过在Sephadex G-75 (Merck)上凝胶过滤除去过量的荧光染料。用缓冲液(mM HEPES，100mM NaCl，pH 7.4)将获得的小单层囊泡(SUV)稀释至0.06 mM的浓度。SUV储存在4 下，并在24小时内使用
　　在室温下，在Perkin Elmer型MPF-66荧光分光光度计上测量SUV中肽诱导的CF渗漏。增加[肽]/[脂]的摩尔比(R 1)是通过向每个含有2.5mL 0.06mM SUVs溶液的比色皿中加入递增等份的肽甲醇溶液而获得的。
　　20分钟后，用λ在520 nm处记录每个比色皿的荧光exc= 488 nm。当时释放的CF的百分比t被确定为%CF =(Ft – F0)/(FT – F0)  100，其中F0是不存在肽时囊泡的荧光强度；Ft，当时囊泡的荧光强度t，在肽的存在下，和FT通过添加50 μL的10% Triton X-100水溶液破坏囊泡来确定总荧光强度。结果和讨论
　　肽合成
　　十五卡宾及其短链类似物通过手动固相合成成功合成N,n′-二异丙基碳二亚胺(DIC)和纯氧马作为活化剂用于除一个偶联步骤之外的所有步骤。事实上，第三个剩余的(Aib)3细分市场，Aib11在DIEA存在下，仅通过TFFH介导的过夜反应有效插入(还需要15分钟的预激活)。
　　使用其他偶联剂导致不完全的Aib11插入，即使在长时间和/或重复耦合后。例如，Oxyma/DIC介导的偶联反应重复三次未能达到定量产率:Aib的偶联12在Aib上13达到约90%的最大产率，而Aib11在Aib上12即使在四个1h偶联循环后也未能达到60%的产率。
　　用TFFH成功完成的后一个困难步骤的产率是通过HPLC测量乙酰化较短序列的量来估计的，所述乙酰化较短序列是从偶联循环后进行的加帽步骤中获得的。
　　所有涉及其它Aib残基的偶联步骤都用Oxyma/DIC进行，但重复两次。此外，这些偶联之后是用乙酸酐封端的步骤。
　　合成后，获得具有相当好纯度的肽，因此仅通过中压液相色谱就可以实现> 90%的纯化。合成肽的HPLC色谱图和HRMS光谱见支持信息.
　　膜扰动能力
　　对含有荧光染料CF的五溴二苯醚及其较短类似物改变不同成分SUV渗透性的能力进行了测试。结果如图。虽然天然序列有效地导致了两种类型SUV的CF泄漏，但是这两种类似物的性能下降，与Aib去除的数量成比例。事实上，当一行天然序列中三个Aib残基中的两个缺失时，干扰模型膜的能力似乎几乎完全丧失。
　　构象分析
　　为了进一步研究我们的肽与模型膜的特殊行为，我们通过CD和2D NMR在溶液中进行了构象分析。
　　在(I)甲醇和(ii)100mM SDS水溶液中的肽溶液上进行CD测量，其形成胶束。结果如图所示。所有肽在甲醇溶液中采用发育良好的螺旋构象。它们的比率R在两个负最大值处的摩尔椭圆率之间表明α-螺旋在甲醇中的比例高于310-螺旋，常见于中长肽段。事实上R大约0.9的值非常接近1，这是与完全α-螺旋结构相关的值。
　　R大于1的值，如在SDS胶束中观察到的值，可能与螺旋聚集体的存在有关。膜中螺旋束的形成通常是肽链生物活性的先决条件。因此，十五卡因及其较短的类似物在溶液中可能采用右旋α螺旋构象，并且在存在胶束的情况下，它们的螺旋在聚集体中自结合。
　　正如已经指出的，自组装的开始改变了肽CD分布，并可能隐藏了其3D结构的一些信息。为了进一步研究肽的螺旋构象并评估其稳定性， 我们在SDS-d胶束的存在下对天然十五肽进行了2D核磁共振分析。正如所料，NOESY光 谱明确证实了α-螺旋构象的存在。光谱中最能提供信息的两个部分，即酰胺质子和指纹区域，在中报告支持信息.
　　由于这些肽在溶液中的3D结构没有显示出任何明显的差异，我们接下来决定通过NMR研究最短的类似物[desAib11,12]十五卡因，因为它显示出干扰我们模型膜的最低能力。为了评估其螺旋构象的稳定性，在没有聚集现象可能影响的情况下，我们记录了其在甲醇中的2D NMR谱。
　　ROESY光谱的两个信息最丰富的区域在图中报告和。检测到几个长程交叉峰，这是完全发育的螺旋构象的诊断。特别是长程α波的存在i  NHi + 4相关性证实了α螺旋的存在。
　　我们的结论是，对于最短的类似物观察到的渗漏活性的损失不能归因于相反似乎保持的螺旋构象的解开。
　　肽两亲性
　　活性的丧失可能是由于几个原因，例如肽/膜结合的变化、肽在水中的聚集或获得跨膜取向的能力。为了阐明通常与膜相互作用相关的两亲性问题，我们绘制了三种肽作为完整α-螺旋的模型信息。
　　首先，我们将它们的长度与所用模型膜的厚度进行了比较，但是我们没有发现相关的差异。五溴二苯醚的三种肽(从第一个NH到最后一个NH)的长度分别为21.47、20.13和18.5312]五溴二苯醚和[desAib11,12]五溴二苯醚。模型膜的总双层厚度约为48，而疏水核心的厚度约为28。因此，肽长度的差异不是渗漏试验中不同性能的主要原因。
　　因此，我们将重点放在螺旋结构的两亲性上，因为这是最影响膜活性的特征之一。三个模型结构沿螺旋轴的视图显示了当C-末端AIB被去除时，(适度的)两亲性特征的明显扰动。
　　事实上，Gln的两个亲水性残基在天然序列中位于螺旋的同一面，一旦从C-末端除去两个Aib残基，就会产生相反的结果。平行地，疏水面受到缺少两个Aib残基的影响:疏水残基Phol15，非常接近低浓铀4瓦尔呢8在天然的五溴二苯醚序列中，位于[desAib12甚至在[desAib]中的两个亲水性谷氨酰胺残基之间11,12]五溴二苯醚。
　　还评估了肽序列中每个Aib残基的重要性。位置1和5上的AIB位于一个螺旋旋转距离处，因此支持构象的开始。有趣的是，Aib残基在这两个位置的存在是中等长度和长长度肽段的共同特征，如阿拉霉素s和trichobrachins。类似地，7位和9位的Aib残基有助于结构稳定。这两个位置的AIB存在于中等长度的肽链如zervamicin的序列中和一些头孢菌素。
　　笔者认为：在这篇文章中，我们提出了一个有效的全合成中等长度的peptaibol十五肽及其两个类似物的方法。设计的固相程序是成功的，尽管存在多达50%的Aib残基，其中三个连续存在。
　　通过TFFH介导的24小时反应，我们成功地获得了最困难的肽键形成的定量产率，即Aib优于Aib-Aib二肽。该方法最有可能扩展到生产含有空间位阻的、自旋标记的氨基酸残基的类似物，如2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基-4-氨基-4-羧酸(TOAC ),适用于肽-膜相互作用机理的光谱研究。也可以合成Aib到Ala的突变体，以进一步研究Aib去除的效果。
　　我们的渗漏实验表明，最短的类似物没有保留十五肽干扰细胞膜渗透性的能力，而光谱研究证实了即使是最短的肽也存在明确的螺旋结构。因此，膜相互作用的差异不能归因于螺旋含量的损失。
　　相反，由于肽C-末端两个Aib残基的缺失扰乱了螺旋的整体两亲性，我们倾向于将膜活性的丧失归因于肽两亲性的降低。肽序列和本文所述肽的渗漏活性之间的特殊相关性可用于进一步研究两亲性在肽自组装和膜相互作用中的作用。
　　参考文献：