人造骨骼肌！水凝胶联合诱导性多能干细胞构建生物工程骨骼肌组织

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　　骨骼肌是一个由多核肌纤维组成，负责发力，并由多种类型细胞支持的复杂组织。许多严重和致命的疾病会影响到骨骼肌，因此，构建这种复杂细胞组成和功能的生物工程模型物对于研究肌肉病理生理和开发治疗方法很有帮助。近日，来自英国伦敦大学学院的Francesco Saverio Tedesco教授团队 进行了三维水凝胶联合人类诱导多能干细胞构建生物工程骨骼肌用于组织、疾病和治疗建模的的相关研究。 研究成果以＂3D human induced pluripotent stem cell–derived bioengineered skeletal muscles for tissue, disease and therapy modeling＂为题于2023年02月15日发表在《Nature protocols 》上。
　　1. 生物工程骨骼肌构造思路及流程
　　图1 生物材料和细胞的试点测试和质量控制
　　本节简要介绍生成单系或多系三维肌肉所需细胞类型的步骤。首先确认支架和生物材料支持形成排列整齐多核骨骼肌纤维的能力 ，如使用原代或永生成年人类肌细胞，比hiPSC衍生的成肌细胞更容易获得。接下来，在分化成特定的衍生物之前对hiPSC起始群体类型、基因组稳定性、多能性和确保无支原体污染进行质量控制。含有血清的培养基（如FBS）可能会产生不同的结果，因此需要从能产生最佳结果的批次中进行批量测试和储备。
　　图2 使用hiPSC衍生原代细胞生成和分析三维骨骼肌构造的工作流程
　　总流程包括三个主要阶段如下。第一步是原代细胞单层扩增，用于制造工程肌肉（步骤1）。本文使用多达四个不同的细胞系（包括两个系祖细胞衍生的两种不同方法选择）：肌纤维，运动神经元，内皮细胞和周细胞。第二步是生成和培养三维人工肌肉构造（步骤2）。选择哪种祖细胞进行扩增是基于所需的构建体类型（如有或没有血管细胞或神经支配）。第三步是在下游应用中使用工程化的肌肉。一些替代的或新的方法来衍生成肌细胞和非成肌细胞系，也可以适用于我们的方法并生成生物工程骨骼肌组织。
　　2. 生物工程骨骼肌表征及应用
　　图3 衍生出的3D生物工程肌肉特征分析
　　图4 利用hiPSC衍生三维肌肉对核包膜异常引起的肌肉萎缩症进行建模
　　图5 体外和体内应用hiPSC衍生的3D人工肌肉的例子：测试基因治疗载体，评估细胞迁移能力和研究生物相容性
　　三维人工肌肉平台可用于模拟正常或患者人类骨骼肌的特性，如肌纤维形成、排列和生长，与支持细胞类型互动，以及肌肉干细胞库的建立。 通过这个平台，本文开创了基于hiPSC的肌肉萎缩症3D模型，揭示了由核包膜蛋白缺陷引起严重肌肉疾病的关键细胞表型特征。三维肌肉在用于模拟骨骼肌层状病变时优于传统的二维细胞单层，三维状态下更好再现了与核包膜基因LMNA潜在突变有关的异常形状细胞核。利用该策略， 本文在三个维度上定义了核主轴长度，作为筛选项目的客观表型读数。核畸形特征与临床表现严重程度呈突变特异性相关，最常见和最严重的LMNA R249W突变的核变形和拉长程度最大。
　　研究人员接着测量了关键下游骨骼肌功能，如收缩力和钙动力学。这些数据可用于开发治疗管道，基于小分子或先进的产品，如基因治疗载体等。 3D构建体的多线性质可以在体外人源化同源平台上测试药物和先进疗法（包括病毒载体和细胞疗法）的细胞特异性、毒性和疗效。为个性化医疗开辟疾病建模之外的新途径，包括药物和疗法测试、毒性研究和体内植入组织替代。 hiPSC衍生的三维肌肉可以用来监测活体组织中的表达，并实时监测。（1）用于DMD临床前基因和细胞治疗研究的非整合、非病毒载体和（2）用于神经肌肉基因治疗临床试验的腺相关病毒载体（AAV）血清类型（AAV9），强调不同转基因剂量的剂量反应相关性，并为进一步的工作奠定了基础，即调查不同AAV血清型的细胞和血统特异性，用于精准医疗。 使用该三维平台评估病毒载体以外的先进疗法的原理证明，并表明可用于评估同源三维肌肉内的肌源细胞移植和迁移，为评估准体内环境中肌源细胞移植提供了一个独特的策略。
　　三维类器官平台大大完善、减少和取代了临床前研究中动物使用。 三维人工肌肉、患者特异性、多细胞和同源性减少体内工作所需的动物数量，验证有限数量的疾病发病机制或治疗/毒性测试实验。进行生物相容性研究显示生物相容性强，并且hiPSC衍生的三维肌肉（包括单系和多系）在免疫缺陷小鼠中受到急性体积性肌肉损伤或损失，血管化并与宿主组织整合，为使用这种方法组织替代战略以及从体外工作中选择疗法的体内测试提供了基础。
　　该平台将通过以下方式创新和加速科学技术的发展： (1) 研究人类肌体生成，以了解衍生的骨骼肌细胞所不能捕捉到的早期疾病表型；(2) 包括来自研究较少但关键的细胞龛进一步分析细胞成分，以及如纤维-脂肪生成祖细胞和肌腱连接超级细胞类型；(3) 掌握新兴微加工和微流体技术，为精准医疗生成先进片上肌肉模型。
　　总之，本文使用人类诱导性多能干细胞进行多系骨骼肌模块化三维生物工程，细胞首先分化为成肌细胞、神经和血管祖细胞，然后在三维水凝胶张力下结合，产生一个包含血管网络和运动神经元排列有序的肌纤维支架。三维生物工程肌肉再现人类骨骼肌形态和功能特征，包括表达肌肉干细胞标记细胞库建立。生物工程肌肉提供一个高保真平台来研究肌肉病理，例如由突变拉明蛋白引起肌肉萎缩症中出现的畸形核。该方法对于有细胞培养经验的操作者来说容易操作，仅需9到30天即可构建，具体时间取决于构建体中细胞系数量。本文还提供该先进平台在体外测试基因和细胞疗法以及体内研究的应用实例，为其作为开发下一代神经肌肉或肌肉骨骼疗法工具的潜力做出原理证明。
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