医思倍动物细胞培养实验细胞复苏细胞传代细胞冻存

　　【实操视频】动物细胞培养实验标准操作：细胞复苏—细胞传代—细胞冻存
　　目的：
　　规范动物细胞扩增培养操作过程，以保证结果的准确、可靠。
　　应用范围：
　　动物细胞培养。
　　实验原理：
　　从活的机体中取出组织或细胞，分散成多个单细胞，模拟机体内的成长环境，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使其在体外环境中继续生长繁殖的过程，并且能够保持其在机体内的结构和功能的技术。
　　试剂准备：
　　(1) PBS：磷酸盐缓冲液，每L含有：
　　NaCl 8g
　　KCl 0.2g
　　Na2HPO4 1.15g
　　KH2PO4 0.2g
　　PH=7.3-7.6
　　不能含有Ca2+和 Mg2+；
　　(2) 胰酶：胰蛋白酶，含0.25%EDTA，PH=7.1-8，长期储存温度为-20 C，使用时建议分装于4 C保存，使用前37 C水浴；
　　(3) 胶原酶：需要现用现配，I 型胶原酶对应上皮组织、肺、脂肪、肾上腺组织，I V型胶原酶推荐用于胰腺组织和胰岛的分离，II 型胶原酶可应用、肝、骨、甲状腺、心脏、唾液腺；
　　(4) 0.4%台盼蓝：使用4G台盼蓝粉末溶于100ml生理盐水或PBS，配置为4%的台盼蓝母液置于4 C保存，用于细胞计数时，稀释十倍，取体积1:1与细胞悬液混合均匀；
　　(5) 冻存液：10%DMSO+90%胎牛血清，使用时可对计数后的细胞沉淀进行重悬到固定浓度。
　　质量控制：
　　细胞的质量控制包括数量、活率、表面标记、支原体和内毒素等。
　　(1) 细胞数量：细胞传代前培养瓶融合率应达到80%；细胞冻存时每管细胞量应达到5*106个/ml以上。
　　(2) 细胞活率：经过冻存的细胞制剂在复苏后细胞活率更不应该低于80%；进行实验时，铺板细胞的活率不应低于90%，且铺板细胞数以活细胞数目为准。
　　(3) 细胞表面标志物：原代细胞的传代质检根据细胞情况检测表面标志物的表达情况。
　　(4) 支原体、内毒素：传代、冻存过程中都要保证无支原体、无内毒素。
　　操作过程说明：
　　1.复苏
　　(1) 从液氮罐中取出冻存管；
　　(2) 迅速放入37 水浴，不时摇动，使其急速融化，30 60s内完成；
　　(3) 冻存管用75％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再加入10ml培养液；
　　(4) 使用低速离心（500 1000r/min）5min，去上清后再用培养液洗一次，重复离心；
　　(5) 弃上清液，用培养液适当稀释后，装入培养瓶进行培养，次日更换一次培养液后，继续培养。
　　2.传代操作
　　(1) 培养基、胰酶、PBS等提前30min使用37摄氏度水浴；
　　(2) 从培养箱拿出细胞，当细胞融合率达到85%以上可开始传代；
　　(3) 吸掉或倒掉培养瓶内旧培养液，使用PBS洗净残留培养基，并倒干净；
　　(4) 向瓶内加入胰蛋白酶液少量，以能覆盖培养瓶底为宜，T25瓶用量为1ml，T75瓶用量为1-2ml；
　　(5) 置37 孵箱或室温（25 ）下进行消化，把培养瓶放在倒置显微镜，观察细胞状态，以细胞全部变圆且轻轻敲打瓶身有部分掉落为准；
　　(6) 直接加入少量含血清的培养基终止消化；
　　(7) 使用弯头吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱落；
　　(8) 使用计数板计数后，判断细胞浓度；
　　(9) 使用离心机离心细胞，使用定量培养基进行重悬，使细胞浓度达到所需要求，分别接种于新的培养瓶中，置CO2培养箱中进行培养；
　　(10) 细胞培养换液时间应根据细胞生长的状态和实验要求来确定，一般2 3d后应换。
　　3.冻存
　　(1) 选对数增生期细胞(证明无支原体污染)，在冻存前1d换液；
　　(2) 按常规方法把培养细胞制备成悬液，计数；
　　(3) 加入配制好的冻存液（90%胎牛血清，10%DMSO），使细胞浓度为1*106个/ml；
　　(4) 用吸管轻轻吹打令细胞重悬，分装入2ml无菌冻存管（提前在冻存管上写清细胞名称、代数、密度、操作人、操作时间）中；
　　(5) 将冻存管转移到程序降温盒（提前4 C预冷半个钟）中，将程序降温盒放入-80 C放置2H以上或过夜；
　　(6) 快速将冻存管转移到冻存纸盒，并放入液氮罐，完成细胞冻存表记录。
　　异常结果报告方式及处理流程：
　　(1) 若细胞复苏后发现异常，如支原体污染、细胞存活率低等，应当及时反馈；
　　(2) 若细胞培养过程中发生异常，如培养液出现浑浊、细胞大量死亡、出现空斑等现象，应当及时报告排除原因；
　　(3) 若细胞培养过程中，出现污染等状况，应当及时报告，并且彻底清洁、消毒实验室；
　　(4) 若细胞存活率低、生长速率慢，在排除细胞自身特性后，应根据细胞代数等原因及时排查，必要时复苏较前代细胞。
　　注意事项：
　　1.实验室准备
　　(1) 定期打扫无菌室：每周打扫一次，使用84消毒液拖地、擦桌子、超净工作台外壁；
　　(2) 培养箱灭菌：使用75%酒精擦拭内壁，再用紫外灯照射；
　　(3) 实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟；
　　(4) 实验后灭菌：用75%酒精擦拭超净台、边台、倒置镜的载物台；
　　(5) 正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染的概率；
　　(6) 点燃酒精灯：使用95%的酒精，注意火焰不能太小，过火时用焰心；
　　(7) 培养箱设置：CO2浓度为5%，湿度为95%，37 。
　　2.物料准备
　　(1) 凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要75％酒精擦拭瓶子的外表面，靠近酒精灯火焰操作；
　　(2) 器皿使用前必须过火灭菌，继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火；
　　(3) 各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不乱碰；
　　(4) 吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。
　　3.垃圾处理
　　(1) 一次性废物处理：储存于黄色医疗废物垃圾袋，定期灭菌丢弃；
　　(2) 废弃培养基处理：集中培养基废液桶中，使用84消毒液进行细胞灭活/灭菌处理，定期交由环保公司处理；
　　(3) 普通垃圾处理：普通垃圾如包装盒、塑料纸等，可与生活垃圾一起处理；
　　(4) 尖锐器物处理：使用较硬的瓶子等集中装好，标注尖锐器物，定期丢弃。
　　4.实验室安全规范
　　(1) 必须始终穿戴适当的个人防护设备，手套污染时应当更换，将用过的手套与其他污染的实验室废物一起处置；
　　(2) 操作可能具有危害的物质后以及离开实验室前应洗手；
　　(3) 在实验室内不能进食、饮水、吸烟、处理隐形眼镜、涂抹化妆品或存放供人食用的食物；
　　(4) 遵守所在机构关于锐器（即：针头、手术刀、吸管和破裂的玻璃器皿）安全操作的准则；
　　(5) 小心操作，尽量避免形成气体挥发或泼溅；
　　(6) 实验开始前、结束后以及可能具有传染性的物质发生泼溅时，应立即使用适当的去污剂对所有工作台面进行去污；
　　(7) 无论实验室设备是否被污染，都应定期进行清洁；
　　(8) 在对可能具有传染性的物质进行处置前应先去除污染；
　　(9) 发生事故可能导致感染性物质暴露时，影响相关人员（例如：实验室主管、安全员）报告。