冷冻电镜是个啥，它到底有多牛？解密冷冻电镜原理

　　说起冷冻电镜（CryoEM），这项技术能斩获诺贝尔奖完全不算是个意外，只不过，2017年度诺贝尔化学奖公布之后，有评论称再次联想到这一奖项的俗名“诺贝尔理综奖”，奖项背后的获得者均有生物物理学背景，影响最大的领域目前则在生物学。
　　生命活动的关键密码在于核酸和蛋白质，核酸因携带遗传物质备受科研界关注，而蛋白质作为生命活动的主要执行者，其结构解析在1960年代崛起。X射线晶体学成像、核磁共振在此前的近80年时间里是生物分子模型的两大主要获得手段。
　　X射线晶体学是最早用于结构解析的实验方法之一。其中关键步骤之一即是，为获得可供X射线衍射的单晶，需要将纯化后的生物样品进行晶体生长。现实情况却是，目前很多复杂的大分子物质难以获得晶体。
　　而核磁共振能解析在溶液状态下的蛋白质结构，因此被认为比晶体结构更能够描述生物大分子在细胞内的真实结构，并且能获得氢原子的结构位置。缺点则在于蛋白质在溶液中往往结构不稳定而难得获取稳定的信号。
　　因此，无论是X射线晶体学成像还是核磁共振，都不能让研究者获得高分辨率的大型蛋白复合体结构，生物结构学领域的发展也因此受困于成像技术。2013年成为了一道分水岭，冷冻电镜在这一年臻于成熟。
　　冷冻电镜打开了长期停滞的局面。研究人员无需将大分子样品制成晶体，通过对运动中的生物分子进行冷冻，即可在原子层面上进行高分辨成像。
　　随后，蛋白质或复合蛋白结构解析领域诸多被称为诺奖级的论文陆续发表，背后的利器正是冷冻电镜，这项技术应用也正式迎来井喷式发展阶段。2015年，国际著名期刊《自然》旗下子刊NatureMethods就将冷冻电镜技术评为年度最受关注的技术。
　　国内冷冻电镜应用领域的领军人物，中国科学院院士、结构生物学家、清华大学副校长施一公在今年5月曾表示，冷冻电镜的发展像是一场猛烈的革命。“就目前发展前景来看，冷冻电镜技术是可与测序技术、质谱技术相提并论的第三大技术！”
　　这项被诺贝尔奖官方称为“使得生物化学进入一个新时代”的技术，其故事的源头则要回到1970年代的理查德亨德森，他将生物分子的观察坚定地引入了电子显微镜这一路径。
　　X射线晶体学的天花板
　　出生于苏格兰，现年72岁的理查德亨德森被公认为是这场高分辨率观察生物大分子革命背后的发起者。
　　亨德森于1969年在剑桥大学分子生物学实验室获得X射线晶体学领域的博士学位，此前则是爱丁堡大学物理学背景。博士毕业后在耶鲁大学做博士后研究，最终于1973年回到剑桥大学至今，目前为剑桥大学MRC分子生物学实验室的主任。
　　起初，亨德森试图用传统的X射线晶体学对一种细胞膜中的内嵌蛋白成像，然而晶体制备这一基础关就难以跨越，内嵌蛋白一旦脱离细胞膜，结构迅速坍塌。数年研究无果后，亨德森意识到X射线晶体学已经到了蛋白质结构解析的天花板，必须将目光投向另一种成像技术。
　　亨德森迷茫之际，冷冻电镜的雏形刚刚建立。
　　1968年，同样在剑桥大学MRC分子生物学实验室里，AronKlug和他的学生DeRosier在Nature上发表了一篇关于利用电子显微镜照片重构噬菌体病毒尾部三维结构的论文，提出并建立了电子显微三维重构的一般概念和方法。AronKlug因此获得1982年诺贝尔化学奖。
　　1974年，加州大学伯克利分校的RobertGlaeser和他学生KenTaylor首次提出冷冻电镜，并测试了冷冻含水生物样品的电镜成像，目的在于降低高能电子对分子结构的损伤，并因此实现高分辨成像。
　　揭开生物分子的原子层面纱
　　1975年，这一年距离电子显微镜诞生已有40年左右时间，其应用在“死”物质里如火如荼，在生物学领域却被普遍认为“不适用”。强电子束、真空腔，这些环境使得生物样品注定被破坏。
　　然而，亨德森在细菌视紫红质（bR，能吸收光能）上的尝试，证明了电子显微镜在生物领域的适用性。
　　亨德森将未脱离细胞膜的细菌视紫红质直接放置在电子显微镜下进行观察，借助表面覆盖的葡萄糖防止真空干涸，并采用强度更低的电子束流，得出细菌视紫红质在细胞膜上是规整排列且朝向一致。之后，在前述AronKlug等人提出的三维重构技术的基础上，亨德森和同事获得了细菌视紫红质较为粗糙的三维立体结构图像。这也是历史上第一张膜蛋白领域的三维结构。
　　这张图像的分辨率达到7埃（，相当于0。7纳米），已经是当时电子显微镜获得的历史最佳蛋白图像。但亨德森的目标是分辨率达到3埃左右，这一清晰水平才能和此前的X射线晶体学成像大致相当。
　　15年后，也就是1990年，亨德森再次对外发布了分辨率达到原子层面的细菌视紫红质立体图像，这一突破性成果有力证明了用电子显微镜进行生物分子成像的潜力。
　　如果说亨德森坚定选择了高分辨率观察生物大分子这条路，那么约阿基姆弗兰克（JoachimFrank）则是冷冻电镜单颗粒分析的鼻祖，耗费十余年时间完成单颗粒三维重构算法及软件Spider。同样是在1975年，弗兰克（JoachimFrank）开始思考如何对电子显微镜获得的二维平面模糊图像进行分析和叠加处理，最终得到更高分辨率的三维立体图像。
　　1981年，弗兰克完成了一种算法，利用计算机识别图像把相同蛋白质的不同影子收集起来，并且将轮廓相似的图像进行分类对比，通过分析不同的重复模式将图片拟合成更加清晰的2D图像。在此基础上，通过数学方法，在同一种蛋白质的不同2D图像之间建立联系，以此为基础拟合出3D结构图像。弗兰克的图形拟合程序被认为是冷冻电镜发展的基础。
　　雅克迪波什（JacquesDubochet）的重要贡献则是在真空环境下使生物分子保持自然形状。几乎是在同期的1978年，迪波什开始解决电子显微镜领域的样品干涸并遭破坏的问题。如前所述，亨德森在细菌视紫红质成像是曾用葡萄糖来保护样品，但这种方法并不普遍适用。
　　迪波什得出的方法是对生物样品进行玻璃化（vitrifyingwater）。一般情况下，通过氢键的相互作用，水分子会在凝固过程中形成有序排列，形成晶体。而迪波什想到的即是在水分子相互作用之前就让其凝固，将生物样品浸入事先经液氮冷却的乙烷中，就能使水迅速冷却、在数毫秒之内完全凝固，这种方式得到的就不是晶体而是无定形态，而玻璃也是处于无定形态，玻璃化名称由此而来。生物样品嵌在无定形冰中，堪称留下了真实的一瞬间。
　　1982年，迪波什开发出真正成熟可用的快速投入冷冻制样技术制作不形成冰晶体的玻璃态冰包埋样品。1984年，迪波什首次发布不同病毒的结构图像。
　　至此，相对容易地使用电子显微镜观察生物大分子的要素基本集齐。
　　当然，冷冻电镜时代的真正来临，还得益于样品制备技术、新一代电子探测器发明、软件算法优化等多方面技术的进步。2013年，加州大学旧金山分校（UCSF））程亦凡和DavidJulius的研究组用冷冻电镜首次得到膜蛋白TRPV1的3。4埃接近原子级别高分辨率三维结构，这一结果被视为具有里程碑意义。
　　国内对于诺奖级助手的热情
　　2013年开始，冷冻电镜成为了诸多诺奖级论文成果的得力助手。在中国国内，这一方面的领军人物是中国科学院院士、结构生物学家、清华大学副校长施一公，其关于剪切复合体的研究基本都利用了冷冻电镜技术。
　　上世纪九十年代中期，清华大学隋森芳院士、中山大学张景强教授、中科院生物物理所徐伟研究员等人开始研究冷冻电镜。真正的布局则在2010年之前，彼时冷冻电镜正蓄势待发。
　　2009年8月25日上午，清华大学医研院FEI电子显微镜合作签字仪式暨亚洲首台KRIOS冷冻电镜安装落成仪式在医学科学楼举行，时任生命科学与医学研究院副院长施一公在合作协议上签字。FEITITANKRIOS300千伏透射电镜是世界上最先进的高分辨场发射冷冻透射电镜，彼时在世界范围内安装完成不超过10台。
　　随后，北京大学医学院、中科院生物物理所也相继采购冷冻电镜。2017年5月，浙江大学更是自筹资金6000万建立冷冻电镜中心，一举成为目前国际上设备配置最齐全、技术覆盖面最广泛的冷冻电镜中心之一。
　　到场参加浙江大学冷冻电镜中心成立庆典仪式的施一公当时发言称，冷冻电镜的发展像是一场猛烈的革命。“就目前发展前景来看，冷冻电镜技术是可与测序技术、质谱技术相提并论的第三大技术！”
　　幸运的是，在业内看来，中国在冷冻电镜的应用方面并不落后。