新手攻略前辈们做WB的累积经验都总结在这里啦

　　Western blot作为科研研究中最为平常的实验，相信大家在该实验中经历过种种磨难吧？现在小助理就把前辈们做WB的累积经验总结起来，希望能帮助到各位科研小伙伴们。
　　WB基本原理
　　在电场的作用下将电泳分离的多肽从聚丙烯酰胺凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测，经常用于目的蛋白的表达特性分析、组织定位、表达量分析及与其他蛋白的互作。
　　依其原理，可分为两种方法：
　　A、直接法和
　　B、间接法。
　　两种的方法的优缺点比较
　　WB的一般流程
　　1、蛋白的提取
　　经验总结：
　　1：合适的盐浓度下，保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。
　　2：尽量除去核酸，多糖，脂类等干扰分子。
　　3：提取蛋白质过程中，应在低温环境下进行，以抑制蛋白酶的水解作用。
　　4：蛋白样品建议分装后冷冻干燥或直接以液体态置-80℃中保存。
　　5：蛋白浓度低时，可使用超滤膜浓缩或者用真空冻干机将蛋白冻干。
　　2、电泳
　　经验总结：
　　1：上样时根据蛋白表达丰度调整蛋白上样量，尽量保证每孔上样量保持一致。
　　2：胶最好现配现用。
　　3：为了检测整个实验系统或校准实验结果，需要设置内参。
　　4：为了确保western blot结果的准确性和特异性，设置合适正确的对照是必不可少。
　　3、转膜
　　用于western blot的杂交膜主要有两种：NC膜和PVDF膜，可依据目的蛋白与膜的结合能力及膜的孔径来挑选不同的转移膜。
　　经验总结：
　　1：胶在负极，膜靠近正极；滤纸不要大过膜，防止短路；
　　2：夹好膜和凝胶后，确定在凝胶、膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全。
　　3：注意一定要戴手套或塑料镊子接触膜，避免手上的蛋白和油脂降低转膜效率。
　　4：转膜过程中，尤其是高电流快速转膜时，通常 会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。
　　5：对于湿转法：一般转膜的电流在200mA-400mA之间，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。大片段的>50KD的可以选用350mA,小片段的可以用250mA。
　　4、免疫印迹
　　经验总结：
　　1：封闭液的选取具体得看抗体说明书，有的抗体是明确要求只能用BSA，而封闭液浓度的选择也是具体得看抗体的要求，但是一般情况5%BSA会比5%牛奶的效果好。
　　2：选择抗体时，一方面需要考虑所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一方面需要考虑所选抗体是否会引起交叉反应条带。
　　WB 实验流程图及相关产品
　　WB 实验常见问题及解决办法
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