色谱峰会分叉？你是不是犯了类似错误？

　　高效液相色谱法作为高效的检测手段，应用范围越来越广泛，做液相色谱的同学基本都会碰到分叉峰，很多时候这都意味着硬件或者方法某些地方可能出现问题，今天我们就跟随小析姐一起看看导致峰分叉的原因以及如何解决这个问题的吧！  1、色谱柱污染
　　在开始时没问题，在使用一段时间后出现这个问题，可能是由于污染引起的。 这时需要对色谱柱加强冲洗，即使用比方法流动相更强的溶剂冲洗色谱柱。 图1中使用纯乙腈冲洗色谱柱消除了3号峰分叉问题。
　　2、保护柱失效
　　如果样品基质比较脏，使用一段时间之后，发现的峰分叉或拖尾等问题，很有可能是保护柱失效造成的。 一般粗略判断标准，塔板数、压力或分离度的改变超过 10%，就需要更换保护柱了。保护柱是消耗品，建议直接更换，不需要再生。  3、接头连接不正确
　　如果色谱柱在使用过程中发现每个峰的峰形都出现问题，先考察是否有连接问题。
　　管线可能太长或太短——这种情况可能导致渗漏或峰分叉/拖尾，如图2所示。如果管线太长，密封圈位置不当，将发生渗漏。如果管线推出的距离不够，将会产生一段死空间，形成混合腔，导致柱外体积，使峰形变坏。 如果您使用的是不同厂商的色谱柱，一定要确保使用正确的接头，并保证色谱柱末端接头位置正确。
　　安捷伦推荐带前后垫圈的 Swagelok 型接头，能让安捷伦液相色谱系统获得最佳性能。在所有仪器连接处都可以使用这种接头，包括阀、加热器、连接色谱柱等。进行良好连接的步骤如图3：
　　4、溶剂效应
　　在反相 HPLC 中，  如使用 100% 有机溶剂或 100% 强溶剂 （图4中为乙腈），大体积进样时，将使色谱峰过早洗脱出色谱柱，导致峰变形。 如需解决这个问题可以对分析物进行蒸发浓缩，从而减少进样体积。或者进样溶剂改为用水稀释，与流动相更为兼容，即使进样体积较大也不会出现峰变形。较早流出的峰或靠近溶剂前沿的峰更容易出现拖尾。在液相色谱中用溶于流动相的小体积进样最为理想。
　　5、样品过载
　　当进样量超过柱子的容量，样品峰会呈现分叉或拖尾，解决方案就是减少进样量。 这种问题一般在使用小体积色谱柱是表现更为明显，所以色谱柱方法从常规250mm或150mm长色谱柱转化到体积较小的快速分析柱时，进样量要按照柱体积的减小的比例而减小。 6、色谱柱塌陷
　　由于柱塌陷引起的峰分叉，很难修复。如果流动相pH>7或在色谱柱pH耐受范围临界点附近长时间使用，是比较容易造成硅胶填料溶解塌陷。如果出现色谱柱塌陷，您会看到色谱图中的每个峰峰形都会发生变化 （峰拖尾、加宽或分叉）如图5，短时间内可以反方向运行，建议直接更换色谱柱。日常使用的过程中注意将温度降低到 40 ℃以下，特别是使用高 pH 流动相时；使用高温兼容色谱柱，如立体保护的硅胶柱、混合型柱、聚合物柱、氧化锆柱等。使用特别适合在较高 pH 下操作的高覆盖率或双交联固定相（比如，ZORBAX Extend-C18），或使用聚合物、混合型或氧化锆反相柱。
　　（a）正常；（b）（c）柱塌陷  7、柱前筛板部分堵塞
　　长期分析脏样品，如果没有保护柱或在线柱前过滤器，颗粒物和强吸附物很可能在柱入口筛板发生堵塞，同时伴随着压力升高，解决办法一般是色谱柱反冲 。1.8um粒径的色谱柱尽量避免反冲。由于现在使用的是高效装柱工艺，不建议更换色谱柱入口筛板，在许多色谱柱上也不可能更换。如果更换筛板，可能影响柱效。所以最好在色谱柱前安装在线过滤器（部件号5067-4638）和保护柱。 8、色谱柱性能下降
　　在您使用色谱柱时， 会用其分析各种目标物、使用各种流动相并分离不同的样品基质，经过长时间的使用，色谱柱会受到这些物质的影响发生一些微妙的变化，从而引起峰分叉、拖尾或保留时间的改变 。在使用新色谱柱时保留其测试样品色谱图非常重要，在使用一段时间后进行比较，就能发现性能上的变化。如果分离度下降导致不能进行良好定量，这根色谱柱就应该丢弃并更换了。
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