咪唑斯汀对小鼠接触性皮炎的治疗作用及机制讨论

　　反应性接触性皮炎( allergic contact dermatitis，ACD ) 是由抗原特异性T 细胞介导的皮肤过敏性疾病，通常是由皮肤直接接触化学物质所致。随着社会经济的发展，ACD 逐渐成为一种普遍的职业病。大量研究表明多种细胞因子，如IFN - 、IL -2、IL - 4 在ACD 的发病中其重要作用。咪唑斯汀是一种特异性外周组胺H 1受体拮抗剂，临床上常用于荨麻疹的治疗。另有报道显示，咪唑斯汀还具有抗过敏、抗炎作用。为进一步证实其抗炎作用，本研究采用DNFB 建立小鼠ACD 模型，观察咪唑斯汀对其的疗效并探究其可能机制。
　　1 材料
　　1. 1 实验动物SPF 级雄性昆明小鼠( 购于湖北省疾控中心实验动物中心) 40 只，体重( 30 5) g。饲养于室温22   25  ，相对湿度40%   50%环境下，混合饲料喂养，自由饮水。
　　1. 2 主要药品与试剂咪唑斯汀原料( 西安杨森制药有限公司) 用5% 羧甲基纤维素钠配制成0. 33gL - 1混悬液，醋酸地塞米松原料( 天津力生制药有限公司) 用5%羧甲基纤维素钠配制成0. 025 gL - 1混悬液，DNFB ( Sigma 公司) 配制成0. 2% 及0. 5%的丙酮溶液。TNF - 酶联免疫试剂盒( 美国Cayman 公司) ， IL - 4、IL - 12 酶联免疫试剂盒( 武汉博士德生物工程有限公司) 。
　　2 方法
　　2. 1 ACD 模型建立将40 只昆明小鼠随机分为对照组、模型组、咪唑斯汀组和醋酸地塞米松组四组，每组10 只。实验小鼠喂养2 周后，腹部同一部位除毛，暴露皮肤; 实验第1 天和第2 天于去毛部位涂抹0. 5% DNFB 溶液25 L 各致敏一次。第6 天在小鼠背部右侧选取3 cm 2 cm 区域除毛，涂抹0. 2% DNFB 25 L 激发。左侧3 cm 2 cm 剃毛区域为对照。在致敏前1 天开始，咪唑斯汀组和醋酸地塞米松组按3. 33 mg kg - 1 和0. 25 mgkg - 1剂量灌药，每天1 次，连续5 d。激发后立即灌药，1次/d，连续灌药3 d。
　　2. 2 皮肤厚度及肿胀度测定激发皮炎24 h 和72h 后，剪取背部右侧及对称左侧皮肤，用电子游标卡尺测量皮肤厚度，测量3 次，取平均值; 然后用直径6 mm 圆形打孔器打取两侧相同面积皮肤，称重，计算对应的皮肤肿胀度。计算公式: 皮肤肿胀度=( 炎症区域皮肤重量- 健康区域皮肤重量) /健康区域皮肤重量 100 %。
　　2. 3 Elisa 法测定小鼠血清及皮肤组织TNF - ，IL -4，IL -12 水平激发皮炎24 h 和72 h 后，分别处死各组小鼠5 只，摘取眼球取血，4 静置过夜后12 000 rmin - 1 离心，分离血清，皮肤组织匀浆后测定蛋白浓度，严格按照Elisa 试剂盒说明书方法测定血清及皮肤组织上清液中细胞因子TNF -， IL - 4， IL - 6， IL - 12 水平。
　　2. 4 统计学方法各组数据以x s 表示，实验数据用SPSS 13. 0 统计软件进行分析处理，组间比较采用LSD - t 检验，P 0. 05 表示差异有统计学意义。
　　3 结果
　　3. 1 咪唑斯汀对DNFB 诱导的皮肤肿胀有明显抑制作用与空白对照组比较，激发皮炎24 h 后，模型组小鼠背部皮肤潮红、充血，明显肥厚，咪唑斯汀组和醋酸地塞米松组小鼠背部皮肤轻微充血，肿胀不明显，皮肤厚度相对于模型组均差异有统计学意义( P 0. 05 ) ; 激发皮炎72 h 后咪唑斯汀组和醋酸地塞米松组皮肤厚度亦显著小于模型组( P 0. 05) 。进一步测定各组小鼠背部皮肤肿胀度，结果显示激发皮炎24 h 和72 h 后，咪唑斯汀组和醋酸地塞米松组皮肤肿胀度显著小于模型组( P 0. 05) 。说明咪唑斯汀能明显抑制DNFB 诱发的背部皮肤充血水肿，且效果与醋酸地塞米松相当。
　　3. 2 咪唑斯汀对血清细胞因子水平的影响诱发皮炎24 h 后，与空白对照组相比，模型组血清TNF- 、IL - 12 水平显著上升( 均P 0. 05) ， IL - 4 无明显变化( P 0. 05) ; 与模型组相比，咪唑斯汀组和醋酸地塞米松组炎症因子TNF - 、IL - 12 显著降低( 均P 0. 05) ， IL - 4 水平亦无明显变化( P 0. 05) 。诱发皮炎72 h 后，模型组TNF - 、IL - 12水平虽有所下降，但仍高于空白对照组( 均P 咪唑斯汀组和醋酸地塞米松组炎症因子TNF - 、IL - 12 水平进一步降低， IL - 4 水平无明显变化( P 0. 05) 。比较咪唑斯汀组和醋酸地塞米松组上述相关炎症因子水平，结果显示均差异无统计学意义( P 均 0. 05) 。
　　3. 3 咪唑斯汀对皮损组织细胞因子水平的影响诱发皮炎24 h 后，模型组皮损组织TNF - 、IL - 12水平显著高于空白对照组( 均P 0. 05) ，而IL - 4无明显变化( P 0. 05) 。与模型组相比，咪唑斯汀组和醋酸地塞米松组炎症因子TNF - 、IL - 12 显著降低( 均P 0. 05) ， IL - 4 水平亦无明显变化; 诱发皮炎72 h 后，模型组TNF - 、IL - 12 水平虽有所下降，但仍高于对照组( 均P 0. 05) 。咪唑斯汀组和醋酸地塞米松组炎症因子TNF - 、IL - 12 进一步降低， IL -4 水平无明显变化( P 0. 05) 。
　　4 讨论
　　ACD 是由一种由T 细胞介导的IV 型变态反应，临床表现为皮肤黏膜接触致敏原后出现弥漫性丘疹、红肿充血。由于其抗原大都属于简单化学物质，很难避免，因此其发病十分普遍，严重影响患者的生活质量。DNFB 是一种常见的化学致敏剂，具致敏和诱发接触性皮炎的双重功能，广泛应用于接触性皮炎动物模型的制备。通常采用DNFB 建立小鼠耳廓ACD 模型，但小鼠耳郭无皮下脂肪层，较薄，不易对耳廓厚度和肿胀度进行精确测定。本研究在传统ACD 模型的基础上，参照冯浩等的方法建立小鼠背部ACD 模型，此模型既能很好的模拟ACD 的病理特征，而且克服了传统耳廓ACD 模型的缺陷。实验结果显示，ACD 模型组背部皮肤出现潮红、充血，明显肥厚等典型的ACD 症状。
　　目前国内外大量研究表明，Th1 型和Th2 型细胞均参与了ACD 的免疫反应，但ACD 主要由Th1型细胞免疫反应所介导。TNF - 和IL - 12均由Th1 型细胞所分泌。在ACD 的激发期，T 细胞接触抗原后TNF - 的释放迅速增加，刺激朗格汉斯细胞迁移，作用于血管内皮细胞，诱导多种细胞因子释放，引起皮肤炎症反应。IL - 12 能够促进Th1 型细胞分泌IFN - ，形成正反馈调节，增强Th1 细胞的免疫应答。本研究结果也显示ACD 组小鼠血清及皮损组织TNF - 和IL - 12 水平显著升高，而血清及皮损组织IL - 4 水平与对照组相比无明显变化。此结果也表面Th1 型细胞免疫在ACD 中起主导作用。咪唑斯汀是一种强效、特异选择性组胺H1 受体拮抗剂，兼具抗炎和抗过敏的双重功效。研究表明，咪唑斯汀通过抑制5 - 脂氧合酶活性来减少白三烯的产生，从而抑制花生四烯酸所诱导的皮肤炎症反应。本研究结果显示，咪唑斯汀能明显抑制DNFB 诱发的小鼠背部皮肤充血水肿，且能显著降低血清及皮损组织中TNF- 和IL - 12 水平。提示咪唑斯汀对ACD 的抑制作用可能与其抑制Th1 型反应有关。