腺病毒介导凋亡素基因对人胆管癌细胞凋亡的研究

　　毕业论文
　　【摘要】  目的 探讨凋亡素基因转染对人胆管癌细胞凋亡的影响，为胆管癌的治疗探索新方法。方法 采用含凋亡素基因的重组腺病毒感染胆管癌细胞株QBC939，在确定其感染复数后通过光镜、荧光观察其凋亡情况，同时通过TUNEL染色统计凋亡率。结果 胆管癌细胞株QBC939的重组腺病毒的感染复数为65，在感染后第3天凋亡素基因能引发胆管癌细胞株QBC939的凋亡，并且随着时间的推移其作用越明显，在第7天凋亡率达到61.9%。结论 凋亡素能明显引发人胆管癌细胞的凋亡，在胆管癌的治疗上具有较大潜力。
　　【关键词】  凋亡素基因； 腺病毒载体； 基因治疗； 胆管癌
　　【Abstract】  Objective  To study the effect of adenovirus mediated apoptin gene on apoptosis of human bile duct carcinoma cells and explore new ways to manage bile duct carcinoma. Methods  The human bile duct carcinoma cell line QBC939 was transfected by recombinant adenovirus carrying apoptin gene. After the multiplicity of infection was determined successfully, the apoptosis of human bile duct carcinoma cell line QBC939 was observed by light microscopy and fluorescence microscopy and the rate of apoptosis detected by TUNEL stain. Results  The value of multiplicity of infection of human bile duct carcinoma cell line QBC939 transfected by recombinant adenovirus was 65. Apoptin gene started to induce the apoptosis of human bile duct carcinoma cell line QBC939 on the 3rd day and the induction function of apoptin gene increased with time. The apoptosis index of human bile duct carcinoma cell line QBC939 reached 61.9% on the 7th day. Conclusion  The apoptin gene can obviously induce the apoptosis of human bile duct carcinoma cell line QBC939, and may be a powerful tool to treat cholangiocarcinoma.
　　【Key words】  Apoptin gene;  Adenovirus vector;  Gene therapy;  Cholangiocarcinoma
　　凋亡素， 又称Apoptin(apoptosis induction)，是来源于鸡贫血病毒(chicken anemia virus,CAV)的小分子蛋白质。它能引发1些肿瘤细胞和转化细胞的凋亡，而对正常细胞无此作用。这提示凋亡素在肿瘤的治疗上具有较大潜力［1］。目前胆管癌的治疗效果难尽人意，迫切需要探索新的治疗方法。本实验利用腺病毒为载体转染人胆管癌细胞株，以观察凋亡素基因对人胆管癌细胞凋亡的影响程度，以期探索治疗胆管癌的新方法。
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　我们已成功构建含凋亡素基因的重组腺病毒载体［2］。不含目的基因的腺病毒载体由第3军医大学西南医院烧伤研究所贺伟峰提供；人胆管癌细胞株QBC939由本研究所王曙光建株［3］；Cytospin 3型细胞离心机购自美国Shandon公司；TUNEL试剂购自德国Roche公司。
　　1.3  统计学分析
　　SPSS 10.0统计软件对数据进行分析，各组间分别进行独立样本t检验检测均值， 结果用 s表示。
　　2  结果
　　2.1  胆管癌细胞株QBC939的最适腺病毒MOI值
　　A：重组腺病毒组光镜图； B：重组腺病毒组荧光图； C：空病毒组光镜图； D：空病毒组荧光图
　　图1  胆管癌细胞株QBC939的最适腺病毒为65的光镜和荧光观察结果  ( 400)
　　2.2  重组腺病毒感染QBC939细胞后的变化
　　2.3  腺病毒感染后QBC939细胞的TUNEL染色及统计结果
　　我们的实验中胆管癌细胞含有荧光蛋白，所以采用复染后封片观察。其阳性结果是细胞核染成棕色，而非凋亡细胞则为蓝色。从图3可看出，含凋亡素基因的腺病毒感染胆管癌细胞后出现细胞核的棕色染色较空病毒组和空白对照组明显增多。
　　从图4可看出， 随着时间的推移， 含凋亡素基因腺病毒感染QBC939细胞的凋亡率是逐渐增高。从第3天开始， 含凋亡素基因的腺病毒组的凋亡率较其他两组明显增高。随着时间的延长， 差异越来越明显。这充分说明凋亡素基因能引发胆管癌细胞株QBC939的凋亡。含凋亡素基因的腺病毒组的凋亡率在第7天可达61.9%， 而空病毒感染的QBC939细胞的凋亡率为10.91%， 正常QBC939细胞的凋亡率为6.89%。显示正常的胆管癌细胞是存在凋亡的， 但凋亡率较低。含凋亡素基因的腺病毒引发QBC939细胞的凋亡较空病毒组和空白对照组明显增高， 表明凋亡素能引发胆管癌QBC939细胞的凋亡。
　　A：重组腺病毒组光镜图； B：重组腺病毒组荧光图； C：空病毒组光镜图； D：空病毒组荧光图
　　图2  腺病毒感染QBC939细胞后7 d的光镜和荧光观察结果  ( 400)
　　A：重组腺病毒组爬片结果； B：重组腺病毒组甩片结果； C：空病毒组爬片结果；
　　D：空病毒组甩片结果； E：空白对照组爬片结果； F：空白对照组甩片结果
　　图3  腺病毒感染QBC939细胞后7 d的染色结果  (TUNEL   400)
　　图4  腺病毒感染QBC939细胞后的凋亡率折线图
　　3  讨论
　　正常胆管上皮细胞的更新和凋亡是维持动态平衡的。当其受损， 必然会引发癌基因和抑癌基因的
　　突变， 特别是凋亡相关基因的突变， 使本该凋亡的缺陷细胞得以生存， 并不断增殖而可能形成肿瘤。所以胆管癌的发生、 发展也是机体引发凋亡失败的结果。当胆管癌形成后由于局部缺血、 基质反应失控和内在凋亡机制的激活会出现自发的凋亡现象［4］。张丰深等［5］发现胆管癌临床标本的自发凋亡率约为7.89%， 而且低分化和具有转移潜能的胆管癌细胞的自发凋亡率较低。由此判断自发凋亡率低的胆管癌细胞可能具有更多的逃避凋亡的机制， 因此， 诱发转化的胆管上皮细胞和胆管癌细胞的凋亡在预防和治疗胆管癌以及抑制其转移都具有重要意义。
　　【参考文献】
　　［2］ 陈健，李大江，王曙光.凋亡素基因重组腺病毒的构建.消化外科，2006，5
　　(4)：269-273.
　　［5］ 张丰深，何振平，马宽生，等.胆管癌组织中自发细胞凋亡现象的研究.中国肿瘤临床，2000，29
　　(6)：381-383.
　　［6］ Heilman DW, Green MR, Teodoro JG. The anaphase promoting complex: a critical target for viral proteins and anti cancer drugs. Cell Cycle,2005,4
　　(4):560-563.
　　［8］ Noteborn MH. Apoptin acts as a tumor specific killer: potentials for an anti tumor therapy. Cell Mol Biol,2005,51
　　(1):49-60.