木薯种质资源离体保存技术研究

　　摘要：为探讨木薯（Manihot esculenta Crantz）种质资源的离体保存方法，以GR891木薯品种试管苗为试材，研究了植物生长抑制剂（PP333、B9、S3307、ABA）对试管苗在常温（25  ）条件下的保存效果。结果表明，在培养室温度（25 2）  、光照度1500 2 000 lx、光照时间12 h/d的条件下，培养基中加入PP333、B9和S3307均可提高木薯试管苗的存活率。在MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖 30 g/L+琼脂6.5 g/L培养基上，木薯常温保存的适宜PP333质量浓度为1.0 1.5 mg/L或B9和S3307质量浓度均为0.5 1.0 mg/L，保存240 d时存活率超过90%，试管苗根系发达、叶色浓绿、生长健壮，0.2 2.0 mg/L ABA培养基上试管苗长势和存活率都明显低于CK（对照）。
　　关键词：PP333；B9；S3307；ABA；木薯（Manihot esculenta Crantz）；离体保存；试管菌
　　中图分类号：S533 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）08-2120-04
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.08.053
　　Abstract：The study aims to investigate the preservation methods of cassava germplasm in vitro.With material as cassava varieties GR891 cassava tissue culture plantlets，Study on the plant growth retardants （PP333，B9，S3307，ABA） on in vitro preservation at room temperature （25  ） temperature conditions. The results showed that in the culture room of temperature（25 2）  ，light intensity 1 500 2 000 lx and illumination time of 12 h/d，the survival rate of cassava test-tube plantlet conserved on medium with PP333，B9 and S3307 could be improved.On the medium of MS+6-BA 0.2 mg/L+ NAA 0.1 mg/L+ sucrose 30 g/L+agar 6.5 g/L，the optimum concentration of PP333 was between 1.0 1.5 mg/L，while B9 and S3307 both were 0.5 1.0 mg/L which would be suitable for inhibiting the growth of cassava plantlets，and improving the survival rate.After 240 d preservation，the average survival rate amounted to about 90%. Conservation plantlets in vitro have flourishing root system， much green leaf， robust growth. And 0.2 2.0 mg/L ABA medium， the growth and survival rate of plantlets were obviously lower than CK （contrast）.
　　Key words： PP333；B9；S3307；ABA；cassava（Manihot esculenta Crantz）； preservation in vitro；test-turb plantet
　　木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科（Euphorbiaceae）木薯属（Manihot）的灌木状植物，是世界三大薯类作物之一，素有＂地下粮仓＂、＂淀粉之王＂等美称[1]，广泛栽培于热带和亚热带地区，在中国广为栽培，木薯的栽培及加工利用在农业生产中占有重要的地位。目前世界各木薯生产国收集保存的木薯种质已有8 500多份[2]，在海南儋州建立了中国最大的木薯种质资源圃。国内主要采用种质资源圃的形式对木薯种质资源进行保存，这种保存方式需要大量的土地和人力资源，成本高，保存数量有限，且易遭受各种自然灾害的侵袭[3]。
　　随着现代生物技术的快速发展，活体植物的组织培养技术和分子生物学技术已成为种质资源离体保存、利用和管理的重要手段[4，5]，同时为长期有效地保存木薯种质资源提供了新的有价值的手段，由于其具有省时、省地、省空间和无病虫害侵害等优点，目前正广泛用于生产实践的各个领域。如何在常温条件下让保存的种质以缓慢生长，达到延长继代时间，减低培养成本的目的，是当前种质资源离体保存技术的重要研究课题。缓慢生长保存是指通过添加生长抑制剂或延缓剂、提高培养基的渗透压、改变植物生长培养条件来限制培养物生长，从而延长继代时间，目前已有部分学者通过组织培养的技术，利用生长抑制剂进行香果树、黄独和巴戟天试管苗离体保存研究[6-8]。前人对木薯离体保存研究鲜有报道，朱文丽[9]通过调整培养基成分、蔗糖和甘露醇，获得木薯离体保存较好的培养基配方。欧文军等[10]对木薯离体保存进行了研究，筛选出的卡那培养基可使木薯试管苗保存延长24个月。笔者在木薯胚性愈伤组织离体保存研究方面也取得了一定进展[11，12]，但有关生长抑制剂对木薯试管苗离体保存的研究尚未报道，因此，本研究以由广西壮族自治区亚热带作物研究所提供GR891木薯品种为试材，旨在研究植物生长抑制剂对木薯试管苗离体保存的影响，以达到延长保存时间和提高存活率的目的。   1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　木薯优良品种GR891为广西亚热带作物研究所选育。
　　1.2 木薯无菌苗的诱导
　　从室温大棚取带有腋芽的木薯嫩枝为外植体，剪去叶片，将茎段两端剪掉，剪成带1个腋芽、长1.5 2.5 cm的小段，用自来水洗净，在超净工作台上用75%乙醇浸泡8 10 s，再用0.1%升汞消毒10 min，无菌水冲洗4遍。在培养温度为（25 2） ，光照度1 500 2 000 1x，光照时间12 h/d的条件下，将已消毒的芽接种至MS+6-BA 1.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L培养基[13]上进行不定芽诱导，约30 d后将不定芽分切出来，转接到增殖培养基MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，约25 30 d为1个周期进行继代培养，连续继代培养2次。
　　1.3 木薯组培苗的离体保存
　　将木薯带芽茎段无菌苗（0.5 1.5 cm）接种到培养基上进行多效唑（PP333）、比久（B9）、烯效唑（S3307）和脱落酸（ABA）的单因子试验。以MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖 30 g/L+琼脂 6.5 g/L的培养基为对照（CK），分别添加不同浓度的PP333 （0.5、1.0、1.5、3.0 mg/L）、B9（0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L）、S3307 （0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L）和ABA（0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L），以上各试验每处理接种10瓶，每瓶接种4个材料，3次重复。培养条件为：温度（25 2）  、光照度1 500 2 000 lx、光照时间12 h/d，试验时间为240 d。
　　保存至180 d观测指标包括：植株的高矮、侧芽、叶片的状态及植株长势等。存活率试验数据于保存后60、120、180和240 d用Excel 2003进行数据统计，对3次重复的试验数据采用SPSS数据处理软件处理。存活率=存活株数/接种株数 100%。
　　2 结果与分析
　　2.1 不同生长抑制剂对木薯试管苗保存180 d形态指标的影响
　　为研究不同生长抑制剂在木薯试管苗保存中的作用，使用了PP333、B9、S3307和ABA 4种植物生长抑制剂，观测了保存中试管苗的株高、侧芽、根、叶片以及植株长势情况（表1）。由表1可知，保存180 d时，当PP333浓度为1.0 1.5 mg/L时，试管苗均能长出1 2个侧芽，植株高大，上端触及培养瓶盖，叶片浓绿、宽大、肥厚；当PP333浓度达到3.0 mg/L时，株高和叶片开始变小，无侧芽，色泽不绿，植株纤细。高浓度的PP333对试管苗的生理损伤较大，降低PP333的使用浓度，能减少对材料的伤害，并使材料保持健壮。因此，PP333使用浓度宜在1.0 1.5 mg/L。
　　当B9和S3307浓度为0.5 1.0 mg/L时，试管苗均能长出1 3个侧芽，并且叶片浓绿、宽大、肥厚，植株健壮、侧芽较多，生根率较高，试管苗存活时间长，成活率高，形态正常，利于继代培养；当B9和S3307浓度为2.0 mg/L时，株高和叶片开始变小，随着浓度的升高而形态更小，色泽淡绿，植株长势均表现较差。
　　ABA对保存中试管苗的生长影响较大，保存180 d时， ABA浓度1.0 2.0 mg/L培养基上植株叶片开始发黄，色泽淡绿，提前老化，早衰现象明显；ABA浓度为0.2 0.5 mg/L时，尽管色泽绿，但植株矮小、茎芽畸形，存活率普遍较低。因此，综合生长和存活情况，ABA浓度0.2 2.0 mg/L均不利于GR891木薯试管苗的离体保存。
　　2.2 PP333对木薯试管苗保存的影响
　　由图1可知，保存期间PP333处理的木薯试管苗存活率明显高于对照，低浓度PP333有利于提高试管保存的存活率。除3.0 mg/L外，3个不同浓度PP333处理的木薯试管苗均与对照CK的保存存活率差异显著（除60 d外），在保存后期（180 240 d）PP333浓度为1.0 1.5 mg/L时，试管苗存活率最高，保存240 d时存活率分别达90.6%、92.8%，处理之间差异不显著，与浓度为0.5、3.0 mg/L差异显著，当浓度提高到3.0 mg/L，对试管苗表现出毒害作用，死芽现象严重，保存存活率随着时间的延长而快速下降。综合分析认为， 生长抑制剂PP333在木薯试管苗保存中适宜浓度为1.0 1.5 mg/L。
　　2.3 B9对木薯试管苗保存的影响
　　在培养基中加入一定浓度的B9可减缓植株生长，延长保存时间。由图2可以看出，整个保存期间木薯试管苗存活率随着B9浓度（0.2 1.0 mg/L）的升高而升高，0.5、1.0 mg/L处理一直维持在一个较高的水平上，在保存前期（60 120 d），各处理存活率与对照组相差不显明；在保存后期（240 d），除0.5 mg/L浓度外，各处理与对照差异显著，其中1.0 mg/L浓度的B9保存240 d时，存活率高达93.4%，与浓度为0.5 mg/L处理之间差异显著，与浓度为0.2、2.0 mg/L处理之间差异显著。随着B9浓度的不断升高（2.0 mg/L），木薯试管苗存活率开始下降，保存后期（240 d），存活率为75.6%，这可能是由于高浓度处理超出了细胞的生理耐受和反应极限，破坏了正常细胞生理活动引起的。因此，适当浓度的B9（0.5 1.0 mg/L）可以有效提高木薯试管苗的存活率。
　　2.4 S3307对木薯试管苗保存的影响
　　从图3可以看出，保存60 d时在外加生长抑制剂S3307时，4种浓度水平对木薯试管苗的保存影响差别不明显，各处理存活率均与对照差异不显著。保存120 d低浓度S3307（0.2 1.0 mg/L）各处理仍有较高的存活率，随着保存时间延长存活率开始缓慢下降，保存240 d时，处理浓度为0.5 1.0 mg/L时其存活率仍达到90.1%、93.6%，处理之间差异不显著，与0.2、1.0 mg/L处理差异显著。这可能是因为木薯自养能力较强，试验所用的营养水平均在试管苗适应保存生长范围之内，综合分析认为，生长抑制剂S3307在木薯试管苗保存中适宜浓度为0.5 1.0 mg/L较合适。   2.5 ABA对木薯试管苗保存的影响
　　由图4可知，ABA处理与对照相比，处理组试管苗保存成活率低，当ABA浓度 0.5 mg/L时，顶芽明显不向上生长，植株矮小，叶片变小，色泽不绿，大部分顶芽褐死，叶片严重发黄萎蔫。随着浓度的升高抑制越强，剂量效应越明显，从而导致植株死亡，保存240 d时，ABA浓度为0.2 mg/L的存活情况相对最好，为65.2%。因此，ABA浓度0.2 2.0 mg/L均不利于GR891木薯试管苗的离体保存。
　　3 小结与讨论
　　离体保存成功的关键因素之一是使用合适的植物生长抑制剂[14]。植物生长抑制剂具有很强的抑制细胞生长的生理活性。添加植物生长抑制剂，不仅能延长培养物在试管中的保存时间，而且能提高试管苗质量和再次继代成活[15]。在种质资源离体保存过程中，缓慢生长法是通过调节培养温度和改变培养基成分来抑制保存材料的生长和延缓材料衰老从而延长继代时间的一种保存方法[16]。因此探索适用于试管苗的高效节能保存方法，对开辟植物种质保存的新途径非常有意义。
　　本研究结果表明，PP333、B9和S3307均能有效地延长保存时间和提高存活率，且培养基上试管苗的长势都明显较对照好，在培养基中添加1.0 1.5 mg/L PP333对木薯试管苗保存效果最好，能够有效延长木薯试管苗继代间隔时间，保存240 d的存活率达90%以上，试管苗生长缓慢，生长量较少，叶色浓绿、叶片宽大、肥厚，这与李锋等[8]在巴戟天上的研究结果一致。
　　有学者曾对马铃薯[17]和猕猴桃[18]的种质保存试验中，应用较低浓度的ABA能明显提高保存效果。但在研究中添加ABA后明显降低保存中试管苗的存活率，植株均表现最先出现叶片黄化、早衰等症状。这与付传明等[14]研究结果一致，综合生长和存活情况，ABA浓度0.2 2.0 mg/L均不利于木薯试管苗的离体保存，其机理有待于进一步的研究。
　　综上所述，在常温培养条件下，常规培养基中添加一定浓度的生长抑制PP333（1.0 1.5 mg/L）、B9和S3307（0.5 1.0 mg/L）可以有效地延长木薯试管苗保存时间，提高存活率，是一种对木薯种质资源离体保存方法之一，该方法可节省费用，且安全、可靠、无病虫害危害，尤其适用于无性繁殖作物，达到了延长保存时间和提高存活率的目的，对实现资源离体保存中节能高效的目标，具有显著的经济和生态效益。
　　参考文献：
　　[1] 李开绵，林 雄，黄 洁.国内外木薯科研发展概况[J].热带农业科学，2001（1）：56-59.
　　[2] 方 佳，濮文辉，张慧坚.国内外木薯产业发展近况[J].中国农学通报，2010，26（16）：353-361.
　　[3] 杨 青.果树种质离体保存[J].福建果树，2005（4）：26-29.
　　[4] HOWELER R H.Mineral Nutrition and Fertilaization of Cassava[A].In：Cassava Research，Production and Utilization[M].UNDP-CIAT Cassava Program，ail，Colombia，1985.249-320.
　　[5] HOWELER R H. Soil Conservation Practices in Cassava-bassed Cropping Systems[A]. In： TAY T H， MOLHTARUDDIN A M， ZAHARI A B.（eds） Poceedings Intenlational Conference Steepland Agriculture in Humid Tropics[C]. Kuala Lumpur. Malaysia，1987.490-517.
　　[6] 洪森荣，尹明华.5种植物生长抑制剂对香果树种质离体保存的影响[J].亚热带植物科学，2009，38（4）：18-21.
　　[7] 尹明华，聂凤琴，邓小艳，等. PP333、B9和ABA对黄独种质离体保存的影响[J].黑龙江农业科学，2011（7）：20-21.
　　[8] 李 锋，付传明，黄宁珍，等.巴戟天种质离体保存研究[J].广西植物，2008，28（1）：95-99.
　　[9] 朱文丽.木薯胚胎发生再生植株及离体保存技术的初步研究[D].海口：华南热带农业大学，2006.
　　[10] 欧文军，罗秀芹，李开绵.一种木薯种质资源离体保存方法的初步研究[J].中国农学通报，2014，30（31）：250-253.
　　[11] 黎 萍.木薯胚性愈伤组织离体保存条件的筛选[J].中国热带农业，2014（5）：53-55.
　　[12] 黎 萍，黄秋伟，彭靖茹，等.木薯胚性愈伤组织诱导及其离体保存的研究[J].江苏农业科学，2014，43（2）：48-52.
　　[13] 黎 萍，彭靖茹，苏文潘，等.木薯外植体表面灭菌与增殖培养的研究[J].安徽农业科学，2011，39（32）：19698-19699，19702.
　　[14] 付传明，黄宁珍，赵志国，等.广西地不容种质离体保存技术研究[J].广西科学，2007，14（2）：155-l59.
　　[15] 张石诚，刘祖祺.植物化学调控原理与技术[M].北京：中国农业大学出版社，1999.
　　[16] NEGASH A，KRENS F，SCHAART J，et al.In vitro conservation of enset under Slow-growth conditions[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture，2001，66（2）：107-111.
　　[17] 林长春，李其文.马铃薯块茎培养脱毒与种质资源试管苗保存的研究[J].马铃薯杂志，1989，3（2）：73-78.
　　[18] 郭延平，李嘉瑞，吉爱梅.ABA对猕猴桃种质离体保存的生理效应[J].西北农业学报，1994，3（4）：84-87.