酒石酸长春瑞滨的细菌内毒素检查方法验证探究

　　酒石酸长春瑞滨(vinorelbine tartrate)化学名3，4- 二去氢 -4- 去氧 -8- 去甲长春碱二酒石酸盐，属于长春碱类抑制细胞分裂的抗肿瘤药物，主要通过抑制微管蛋白的聚合，使细胞分裂停止于有丝分裂中期，是一细胞周期特异性的药物。临床上主要与其他抗癌药物联合应用于治疗非小细胞肺癌，也可用于晚期乳腺癌、食管癌等。FDA于 1994 年批准酒石酸长春瑞滨用于晚期非小细胞肺癌患者的一线治疗。无菌检查、细菌内毒素检查、微生物限度检查是药品安全性检查的重要项目。
　　本品制剂为酒石酸长春瑞滨注射液，其国内现行标准为《中国药典》，明确规定了细菌内毒素检查的项目与标准。酒石酸长春瑞滨目前国内现行标准为《中国药典》，现标准中未规定细菌内毒素的控制项目与标准。为更好地控制制剂的细菌内毒素水平，对酒石酸长春瑞滨原料开展建立细菌内毒素检查标准与方法的研究，参照《中国药典》(2010年版)二部附录Ⅺ X M 化学药品注射剂安全性检查法应用指导原则及附录Ⅺ E 细菌内毒素检查法、USP(85)BACTERIAL ENDOTOXIN TEST、EP(2.1.6.4)BACTERIAL ENDOTOXIN TEST以及 EP8.0 中酒石酸长春瑞滨细菌内毒素标准、USP37-NF32 中酒石酸长春瑞滨注射液的细菌内毒素标准，建立并验证本品种的细菌内毒素检查标准与方法。
　　1 实验材料
　　1.1 仪器
　　电子分析天平、DHG-9146A 型电热恒温鼓风干燥箱、XW-80A 旋涡混合器、DK-600 电热恒温水槽、HH-2F 净化工作台。
　　1.2 试剂
　　1.2.1 细菌内毒素工作标准品 规格 160EU/ 支，批号 150601-201174，中国药品生物制品检定所。
　　1.2.2 鲎试剂 鲎试剂 1(=0.03EU/mL，规格0.1mL/ 支，批号 1211022，湛江安度斯生物有限公司);鲎试剂 2(=0.03EU/mL，规格 0.1mL/ 支，批号 12060612，福州新北生化工业有限公司)。
　　1.2.3 细菌内毒素检查用水WBET 规格50mL/瓶，批号 13020315，褔州新北生化工业有限公司。
　　1.2.4 碱 性 pH 调 节 剂 规 格 2mL/ 支，批 号121127，褔州新北生化工业有限公司。
　　1.2.5 酒石酸长春瑞滨 批号：130701、130702、130901。
　　2 方法(凝胶法)
　　2.1 试验准备
　　试验过程所用的移液枪等仪器设备必须经过确认并在有效期内;玻璃、不锈钢等容器及用具经250 ，至少 1h 干热灭菌以去除外源性内毒素;塑料器具须经清洗并确证不干扰试验结果;所用的标准品、试剂均在有效期内，鲎试剂初次使用前须进行灵敏度复核。
　　2.2 细菌内毒素限值L
　　酒石酸长春瑞滨注射液的细菌内毒素标准CP2010、USP37-NF32 中分别为按长春瑞滨计，L 6.0EU/mg(CP2010)与 L 3.0IU/mg(USP37-NF32);EP8.0中酒石酸长春瑞滨的细菌内毒素标准为 L 2.0IU/mg(以长春瑞滨计)。综上所述，本次验证取 L 1.0IU/mg(以长春瑞滨计)。
　　2.3 鲎试剂灵敏度复核
　　按《中国药典》(2010 年版)二部附录Ⅺ E 细菌内毒素检查法鲎试剂灵敏度复核试验项下规定进行，所用 2 批鲎试剂的实测灵敏度 c 与标示灵敏度 均一致(0.5 c 2.0)，均符合规定。
　　2.4 供试品最低有效活性浓度C计算
　　当最大有效稀释倍数为 1 时，相对应的浓度即为最低有效活性浓度(Cp)，按 Cp=/L 计算，一般取 C Cp，本次验证 C 取 0.035mg/mL(以长春瑞滨计)。
　　2.5 干扰试验
　　2.5.1 供试品溶液(NPC)的制备 精密称取酒石酸长春瑞滨(批号 130701)适量，用 WBET 溶解成含长春瑞滨为 10mg/mL 的溶液，并用 pH 调节剂调节 pH 为 6.0   8.0，用 WBET 稀释制成浓度为 C 的供试品溶液。
　　2.5.2 细菌内毒素内毒素工作标准品溶液(PC)和细菌内毒素供试品溶液((PPC)制备 用 1mLWBET 将 1 支内毒素工作标准品溶解后，在旋涡混合器连续混合 15min 后，分别用 WBET 和 NPC 稀释成 2、、0.5、0.25 的 PC 和 PPC。在进行下一步稀释前，至少混合 30s。
　　2.5.3 干扰试验过程 取鲎试剂 1、2 各 38 支，分别用 0.1mL WBET 溶解，再分别加入 2、、0.5、0.25 浓度的 PC 和 PPC 各 0.1mL 混和，每一浓度平行做四份。同时用 0.1mL WBET 平行做 2 份阴性对照，用 0.1mL NPC 平行做 4 份阴性对照。将安瓿中溶液轻轻混匀后封闭管口，垂直放入电热恒温水槽中，从放入开始准确记录时间，在(371) 无振动保温(602)min。
　　另取 130702、130901 批酒石酸长春瑞滨同前操作。用 两 个 厂 家 的 鲎 试 剂 对酒 石 酸 长 春 瑞 滨 进 行 干 扰 试 验，结 果 均 符 合0.5 2，0.5 Es 2.0Es。此结果表明，酒石酸长春瑞滨对细菌内毒素检查(凝胶法)无干扰的浓度为 0.035mg/mL(以长春瑞滨计)。
　　3 结果
　　对 3 批酒石酸长春瑞滨进行细菌内毒素检查，结果均符合规定。见表 3。
　　4 讨论
　　经试验，酒石酸长春瑞滨的细菌内毒素限值确定为 L 2.0IU/mg(以长春瑞滨计)，酒石酸长春瑞滨对细菌内毒素检查(凝胶法)无干扰的浓度为0.035mg/mL(以长春瑞滨计)。
　　在本试验条件下，取 3 个批号的供试品，用BET 水分别按上述方法配制成 0.035mg/mL 供试品稀释液，然后用 =0.03EU/mL 的上述两个厂家的鲎试剂各 16 支实验，供试品的 Et 值均在 0.5Es   2.0Es 范围之间，确认无干扰影响。酒石酸长春瑞深经过按细菌内毒素检查法实验后，确证了本品可以用稀释方法排除干扰，用细菌内毒素查法(凝胶法)对供试品进行细菌内毒素的检查结果准确可靠。
　　当细菌内毒素工作标准品、鲎试剂、供试品的生产工艺或试验环境中发生任何可能影响试验结果的变化时，需重新进行干扰试验。
　　供试品溶液和鲎试剂混和液的 pH 值一般在6.0   8.0 之间，在检测前应通过加入合适的 pH 调节剂进行 pH 调节。