科普膜蛋白的简介及提取

　　生物膜的特定功能主要是由蛋白质完成的；膜蛋白约占膜的40% 50%，有50余种膜蛋白；在不同细胞中膜蛋白的种类及含量有很大差异。有的含量不到25%，有的达到75%；一般来说，功能越复杂的膜，其上的蛋白质含量越多。
　　膜蛋白是膜功能的主要体现眷。根据与膜脂的结合方式以及在膜中的位置的不同，膜蛋白分为：整合蛋白（integralprotein）、外周蛋白（peripheralprotein）脂锚定蛋白（1ipid—anchoredprotein）。
　　整合蛋白（IntegraIProteins）：部分或全部镶嵌在细胞膜中或内外两侧的蛋白质；根据跨膜次数将跨膜蛋白分为单次跨膜、多次跨膜、多亚单位跨膜等；整合蛋白约占膜蛋白的70一80%。整合蛋白与膜结合非常紧密，只有用去垢剂（detergent）才能从膜上洗涤下来．常用SDS和Triton—X100。
　　外周蛋白又称为外在蛋白（extrinsicprotein），为水溶性的，分布在细胞膜的表面．靠离子键或其他较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子的亲水部分结合，因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来。
　　脂锚定蛋白（Lipid—anchoredproteins）：又称脂连接蛋白（1ipid—Iinke（1proteins）．同脂的结合有两种方式：一种方式是通过一个糖分子间接同脂双层中的脂结合；一种是蛋白质直接与脂肪层中的脂结合。脂锚定蛋白通过磷脂或脂肪酸锚定，共价结合。分两类．一类是糖磷脂酰肌醇（GPl）连接的蛋白，GPl位于细胞膜的外小叶．用磷脂酶C处理能释放出结合的蛋白。许多细胞表面的受体、酶、细胞粘附分子和引起羊瘙痒病的PrPC就是这类蛋白。另一类脂锚定蛋白与插入质膜内小叶的长哦氢链结合。
　　膜蛋白提取方法
　　膜蛋白具有许多重要的细胞功能，对生物体存在至关重要。他们具有超过 60% 的药物靶点，占细胞总蛋白的 20%-30%。膜蛋白包括完整的膜蛋白，跨膜蛋白和外周膜蛋白。
　　膜蛋白或者附着在脂质双分子层上或者通过疏水，离子或其他非共价与膜周边的完整蛋白结合。
　　使用表面活性剂进行质膜蛋白分离提取效率不高，还有可能破坏蛋白质 - 蛋白质相互作用，改变膜蛋白的拓扑结构。
　　在一些下游应用中，例如膜蛋白 IP，Co-IP，酶检测，质谱分析实验，使用无表面活性剂的方法分离质膜蛋白远远好过使用表面活性剂的方法。多年来，使用无表面活性剂方法提取质膜蛋白大致可以分为以下三类方法：
　　A.传统的蔗糖梯度离心（SGU）：传统的蔗糖梯度离心法自上世纪 60-70 年代开发，至今仍被许多实验室用于质膜蛋白提取，蔗糖梯度离心可以将细胞蛋白分离成不同的组分和高度浓缩的膜蛋白。这种传统的方法需要大量的起始材料，操作过程复杂耗时。
　　B.双水相亲和性分离：此方法的特点是大多数的亲水性聚合物对在水溶液中是不相容的，产生两个共存相，相互平衡。利用这个性质可以分离许多生物分子包括膜蛋白。该方法相对简单，快速，但是所需的起始细胞数相对较高，且产量相对较低。
　　C.离心管柱法：使用离心管柱分离技术起始材料仅需 2*107 个细胞，即可将细胞 / 组织分离为细胞浆，细胞核，细胞器和质膜组分。
　　离心管柱带有特定孔径和表面性质，当细胞通过离心管柱，细胞膜被破裂分离出完整的细胞核，随后通过差速离心和密度离心分离出质膜蛋白，无需使用超高速离心。可以应用于 SDS-PAGE、immunoblottings、ELISA、IP、Co-IP、MS、2-D、酶活性检测等其他应用。
　　离心管柱法膜蛋白提取操作方法：
　　1.将离心管柱及接收管套管放置冰上预冷。
　　2.细胞样品，低速离心（500-600Xg，5 分钟）收集 1-50 X 106 个细胞。接转 3a 步骤。组织样品，接转 3b 步骤。（贴壁细胞样品建议使用细胞刮刀收集，尽量不使用胰酶消化） 注意：从细胞样品中分离质膜蛋白，建议细胞量为 20-50 X 106 个细胞。
　　3a.用预冷的 PBS 清洗一次细胞。去除上清，在 Buffer A 中重悬细胞（起始细胞数小于 5X 106 加入 200ul Buffer A，起始细胞数大于 5X 106 加入 500ul Buffer A）。冰上孵育 5-10 分钟。涡旋大力震荡 10-30 秒。迅速将细胞悬液转入离心管柱中。接转步骤 4.
　　3b.组织样品，将新鲜组织（10-30mg）或冷冻组织（20-30mg）放置于离心管柱上。加入 200ul Buffer A，用塑料棒反复扭转研磨组织 1 分钟（注意：如果你的样品是骨骼或是心肌，建议在研磨前加入 100-200mg 组织分离粉）。再加入 300ul Buffer A，用吸头吹打几次后，开盖冰上孵育 5 分钟。接转步骤 4.
　　注意：存在少量的非均质组织不会影响样品的质量。塑料棒可重复使用。用 75% 酒精擦拭或用蒸馏水冲洗干净。
　　4.盖上盖子，16,000Xg，离心 30 秒。（此步骤推荐使用可在 10S 内达到离心力的台式离心机，离心机的离心力和升速时间会影响膜蛋白得率）优化：细胞样品建议第 4 步完成后再次重悬细胞，转移回离心管柱中，16,000Xg 再次离心 30 秒，重复此步骤可以增加 20-30% 产量。
　　5.弃去离心管柱，涡旋大力震荡 10 秒重悬细胞。
　　6.700Xg，离心 1 分钟（沉淀是完整的细胞核）。将上清转移到新的 1.5ml 离心管中，4 ，16000Xg 离心 10-30 分钟（延长离心时间可以增加产量），弃去上清（上清为胞浆组份），保存沉淀（沉淀为总膜蛋白组份包括细胞器和质膜）。
　　如果不需要分离质膜做到此步骤即可，产量一般为 10-500ug / 样品。可将总膜组份存储于 - 70 或者根据下游实验选择溶解液溶解。如果需要提取质膜，请不要冷冻总膜组份。分离质膜继续第 7 步骤。
　　7.加入 200ul Buffer B 用吸头反复吹打或涡旋震荡重悬总膜蛋白组份。4 ，7800Xg，离心 5 分钟（注意：如果*终质膜组份中含有细胞器膜污染，此步骤离心时间可增加到 20 分钟提高纯度，次使用建议按照说明书操作，无需调整离心时间）。沉淀部分为细胞器。
　　8.小心的将上清液转移到新的 2.0ml 离心管中，加入 1.6ml 预冷的 PBS 混匀几次。16000Xg，离心 15-30 分钟（延长离心时间可以增加产量）。弃去上清液，保存沉淀（沉淀为质膜蛋白）。产量一般为 10-300ug / 样品。质膜蛋白可以根据下游实验需求用 20-200ul 含表面活剂的缓冲液溶解。